HIB綜合培養(yǎng)基、B型流感嗜血桿菌結合疫苗及其制備方法，涉及疫苗生產制備工藝領域，解決了b型流感嗜血桿菌結合疫苗含有血源性成分且易發(fā)生過敏反應，不穩(wěn)定且成本高，核酸、蛋白、內毒素含量高的問題。本發(fā)明的HIB綜合培養(yǎng)基中各成分及其終濃度(g/l)為：酵母浸出粉5～15，葡萄糖5～15，MgCl·6HO 1～3，β-輔酶A 0.01～0.03，氯化血紅素0.005～0.02，NaHPO·12HO 22～32，NaHPO·2HO 2～5。該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過敏原性成分，使得菌種傳代更穩(wěn)定，安全可靠，所制備的B型流感嗜血桿菌結合疫苗內毒素含量低、穩(wěn)定性好，安全有效。

1.HIB綜合培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基中各成分及其終濃度為：
酵母浸出粉5～15g/l，
葡萄糖5～15g/l，
MgCl₂·6H₂O1～3g/l，
β-輔酶A0.01～0.03g/l，
氯化血紅素0.005～0.02g/l，
Na₂HPO₄·12H₂O22～32g/l，
NaH₂PO₄·2H₂O2～5g/l；
該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過敏原性成分。
2.根據權利要求1所述的HIB綜合培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基中各成分及其終濃度
為：
酵母浸出粉10g/l，
葡萄糖10g/l，
MgCl₂·6H₂O2.03g/l，
β-輔酶A0.02g/l，
氯化血紅素0.01g/l，
Na₂HPO₄·12H₂O28.65g/l，
NaH₂PO₄·2H₂O3.12g/l；
該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過敏原性成分。
3.制備利用權利要求1和2中任意一項所述的HIB綜合培養(yǎng)基制備而成的B型流感嗜血
桿菌結合疫苗的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
步驟一、菌種接種與培養(yǎng)
菌種采用編號為CCMC58534的b型流感嗜血桿菌，培養(yǎng)基采用HIB綜合培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基
中各成分及其終濃度為：酵母浸出粉5～15g/l，葡萄糖5～15g/l，MgCl₂·6H₂O1～3g/l，β-
輔酶A0.01～0.03g/l，氯化血紅素0.005～0.02g/l，Na₂HPO₄·12H₂O22～32g/l，NaH₂PO₄·
2H₂O2～5g/l；該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過敏原性成分；
步驟二、對步驟一所獲得的培養(yǎng)液進行殺菌；
步驟三、去核酸
室溫條件下，將殺菌后的培養(yǎng)液離心收集上清液，按照上清液與十六烷基三甲基溴化
銨溶液的體積比為10:1的比例加入十六烷基三甲基溴化銨溶液，使上清液終濃度為0.1％，
混勻后靜置4小時以上，離心收集沉淀物并于沉淀物中加入1mol/L氯化鈉溶液，將沉淀物稀
釋至40～50mg/ml，補加與沉淀稀釋物等體積的注射用水，再加入乙醇至其終濃度為25％，
于2～8℃靜置4小時以上離心收集上清液；
步驟四、沉淀多糖
于收集的上清液中加入乙醇至其終濃度為75％，于2～8℃靜置4小時以上離心收集沉
淀物，用無水乙醇和丙酮依次洗滌沉淀物并真空干燥，所得固體即為多糖粗制品；
步驟五、多糖精制
將多糖粗制品溶解于1/10飽和醋酸鈉溶液中，使多糖粗制品濃度為4～10mg/ml，混勻
后加入等體積、pH為7.0的冷酚溶液，離心收集上清液，采用冷酚溶液提取兩次并合并上清
液，用1mol/L氯化鈉溶液、膜超濾去除殘留苯酚，再加入乙醇至其終濃度為75％，于2～8℃
靜置4小時以上，離心收集沉淀物，用無水乙醇和丙酮依次洗滌沉淀物并真空干燥，所得固
體即為精制多糖；
步驟六、多糖的衍生
將精制多糖用0.85％氯化鈉溶液溶解，精制多糖與0.85％氯化鈉溶液的比例為：10mg:
1ml，再加入溴化氰溶液對精制多糖進行活化，精制多糖與溴化氰的比例為：2mg:1mg，反應3
～10分鐘后調節(jié)pH至8.5，向反應液中加入等體積、濃度為0.25mol/L、經過0.85％氯化鈉溶
液溶解的己二酰肼溶液，反應25～35分鐘，于2～8℃攪拌過夜；反應液用0.85％氯化鈉溶
液﹑膜超濾去除殘留溴化氰和己二酰肼，濃縮至多糖含量24mg/ml以上，獲得多糖衍生物；
步驟七、載體蛋白
載體蛋白采用破傷風類毒素，對破傷風類毒素原液進行純化，收集分子量為150kD的洗
脫液，再采用截留分子量為10kD的超濾膜將純化的破傷風類毒素超濾濃縮至24mg/ml以上，
除菌過濾并分裝；
步驟八、多糖衍生物與載體蛋白的結合
將多糖衍生物與純化的破傷風類毒素等質量混合，調節(jié)pH至5.5～5.8，加入經過
0.85％氯化鈉溶液溶解的碳二亞胺溶液，使終濃度為0.05mol/L，并且使多糖衍生物和破傷
風類毒素的終濃度均為10mg/ml，維持pH5.6反應4小時；用截留分子量為10KD的膜包超濾，
獲得多糖蛋白結合物；
步驟九、多糖蛋白結合物純化
對超濾后的多糖蛋白結合物進行純化，收集洗脫液，除菌過濾后獲得多糖蛋白結合物
原液；
步驟十、配制
采用0.85％氯化鈉溶液稀釋多糖蛋白結合物原液，獲得B型流感嗜血桿菌結合疫苗，每
毫升疫苗溶液中含多糖不低于20μg。
4.根據權利要求3所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟一
中，采用發(fā)酵罐液體培養(yǎng)，起始培養(yǎng)濃度均不低于1.0×10⁹個/ml，于37℃通氣攪拌培養(yǎng)6～
8小時，獲得培養(yǎng)液。
5.根據權利要求3所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟二
中，向培養(yǎng)液中加入終濃度為1.0～3.0％的甲醛溶液，于20～25℃攪拌10～20分鐘，完成對
培養(yǎng)液的殺菌作用。
6.根據權利要求3所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟三
中，于2～8℃靜置4小時以上離心收集上清液的具體過程為：在4℃、4000轉/分鐘的條件下，
離心60分鐘收集上清液。
7.根據權利要求4所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟四
中，于2～8℃靜置4小時以上離心收集沉淀物的具體過程為：在4℃、4000轉/分鐘的條件下，
離心60分鐘收集沉淀物。
8.根據權利要求3所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟五
中，加入飽和醋酸鈉冷酚溶液后離心收集上清液的具體過程為：在4℃、4000轉/分鐘的條件
下，離心60分鐘后收集上清液；于2～8℃靜置4小時以上離心收集沉淀物的具體過程為：在4
℃、4000轉/分鐘的條件下，離心30分鐘收集沉淀物。
9.根據權利要求3所述的B型流感嗜血桿菌結合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟七
中，采用SephacrylS-300柱色譜純化破傷風類毒素原液，洗脫液為0.85％氯化鈉溶液，檢
測波長為280nm；步驟九中，采用Sepharose4FF柱色譜純化多糖蛋白結合物，洗脫液為
0.85％氯化鈉溶液，檢測波長分別為206nm和280nm。