本發(fā)明公開了一種基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶電化學(xué)同時檢測方法，屬于電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域。通過金-巰鍵作用將DNA-多肽復(fù)合物固定到金電極表面，再利用DNA雜交反應(yīng)捕獲DNA-金納米粒子-電子介體納米信號探針。當(dāng)靶標(biāo)蛋白酶存在時，胰蛋白酶剪切多肽上的精氨酸羧基位點，糜蛋白酶剪切另一條多肽上的酪氨酸羧基位點，使得連接于多肽上的相應(yīng)的納米信號探針脫離電極表面，導(dǎo)致相應(yīng)電子介體的峰電流下降，據(jù)此，可實現(xiàn)胰蛋白酶和糜蛋白酶的靈敏性和選擇性同時檢測。

1.一種基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶電化學(xué)同時檢測方法，其特征在于：將金電極浸入DNA1-多肽1和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小時，用1mM的巰基己醇封閉1小時，再浸入含有DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂鐵納米信號探針的溶液中，通過DNA雜交反應(yīng)將兩種納米信號探針固定到電極表面，制備成電化學(xué)傳感器；將電化學(xué)傳感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反應(yīng)25分鐘，胰蛋白酶剪切多肽1上的精氨酸羧基位點，糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位點，使得連接于多肽上的相應(yīng)的納米信號探針脫離電極表面，導(dǎo)致相應(yīng)的電子介體硫堇和二茂鐵的峰電流下降，隨著胰蛋白酶和糜蛋白酶濃度的增大，硫堇和二茂鐵的峰電流逐漸減小，峰電流減小的程度分別與胰蛋白酶和糜蛋白酶在0.006-0.18μg/mL和0.0055-0.25μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限分別為2.5ng/mL和1.6ng/mL，表明本發(fā)明建立傳感方法可用于對多種蛋白酶的高靈敏和特異性同時檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶電化學(xué)同時檢測方法，其特征在于：DNA-AuNPs-電子介體納米信號探針的制備方法包括以下步驟：（1）金納米粒子的制備：50mL的0.01%HAuCl₄溶液在不斷攪拌的情況下加熱至沸騰，然后加入1mL質(zhì)量濃度為5%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌并保持沸騰狀態(tài)，直至溶液顏色由黃色變成深紅色，繼續(xù)保持沸騰10分鐘，自然冷卻至室溫，將制備的金納米粒子放在4°C冰箱中保存；（2）DNA-多肽復(fù)合物的制備：將200μL25μM多肽、200μL5μM的DNA和1mg/mL鏈霉親和素混合均勻，室溫下反應(yīng)3小時，未反應(yīng)的DNA和多肽經(jīng)6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速超濾5分鐘除去，得到DNA-多肽復(fù)合物，于4°C保存；（3）電化學(xué)納米信號探針的制備：將0.3mL25μM的巰基DNA與4.7mL12nM的金膠混合反應(yīng)24小時，制備的DNA-AuNPs復(fù)合物用1M的NaCl穩(wěn)定；將0.2mL0.1mM的電子介體加入0.2mL的DNA-AuNPs溶液中，在25oC持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時，加入1mL質(zhì)量濃度1%的BSA，反應(yīng)1小時；所得溶液在16000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，去除上層清液，將產(chǎn)物重懸于濃度為10mM、pH為7.7的磷酸鹽緩沖溶液中，制成DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂鐵納米信號探針。