本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建的可以產(chǎn)較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOX基因工程菌，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2012266。在甲醇誘導(dǎo)階段通過(guò)添加山梨醇來(lái)提高葡萄糖氧化酶的酶活:即控制發(fā)酵液中甲醇?xì)埩魸舛?.8%(W/V)，且甲醇與山梨醇混合添加比例為10:1(W/W)時(shí)，葡萄糖氧化酶的酶活為645.3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了50.9%，而且有效縮短了發(fā)酵周期，這為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1.一種發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，以一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，
保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2012266，于2012年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；
其特征在于將活化后YPD擴(kuò)培的菌液接入全自動(dòng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵處理，接種
量為10％，以25％氨水控制pH5.5，溫度30℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30％以上；
當(dāng)甘油耗盡溶解氧迅速上升時(shí)，開(kāi)始流加50％甘油補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，當(dāng)菌體干重達(dá)到100g/L
后，停止補(bǔ)料；待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)1h后，開(kāi)始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘
導(dǎo)條件為：溫度降低至20-25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1-5:1(W/W)，并
且維持整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程的甲醇濃度為1.5-2.5％(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于誘導(dǎo)條件優(yōu)選：溫度降低至22℃，控制甲
醇和山梨醇的混合添加比例為10:1(W/W)，并且維持整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程的甲醇濃度為1.8％
(W/V)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶表達(dá)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：85％磷酸26.7mL/L,CaSO₄
0.93g/L,K₂SO₄18.2g/L,MgSO₄·7H₂O14.9g/L,KOH4.13g/L,甘油40.0g/L,PTM₁4.35mL/L,
25％氨水調(diào)pH5.5；其中每升PTM₁組成為：CuSO₄,6.0g；KI,0.08g；MnSO₄,3.0g；Na₂MoO₄,
0.2g；H₃BO₃,0.02g；CoCl₂,0.5g；ZnCl₂,20.0g；FeSO₄·7H₂O,65.0g；biotin,0.2g和98％(w/w)
H₂SO₄,5mL。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基：50％(W/V)甘油，其中含
12mL/LPTM₁。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：含12mL/LPTM₁
的100％甲醇與含12mL/LPTM₁的山梨醇混合之比為10：1(W/W)。