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一種固定化酶催化合成NADPH的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2022-02-04
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201710929892.7 
  • 技術(專利)名稱 一種固定化酶催化合成NADPH的方法 
  • 項目單位 蘇州人本藥業有限公司
  • 發明人 秦正紅 
  • 行業類別 藥品-原材藥
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 秦莉茜
  • 發布時間 2022-02-04  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種固定化酶催化合成NADPH的方法,包括以下步驟:(1)在二價金屬離子存在下,以NAD和偏磷酸鹽為底物配制成第一反應液,向第一反應液中加入固定化NAD激酶,催化合成NADP;(2)去除第一反應液中的固定化NAD激酶,繼續加入葡萄糖配制成第二反應液,向第二反應液中加入固定化葡萄糖脫氫酶,催化合成NADPH。上述方法實現了以連續反應合成NADPH,生產工藝簡單,生產周期短,生產成本低,產品質量更加穩定;另一方面,采用固定化酶催化制備NADPH,固定化酶能夠連續、反復多次使用,進一步降低了生產成本,避免了產物中引入蛋白雜質,固定化酶應用于上述方法中有利于生產高純度和高收率的NADPH。
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  • 02

    說明書

    1.一種固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)在二價金屬離子存在下,以NAD和偏磷酸鹽為底物配制成第一反應液,向所述第一反應液中加入固定化NAD激酶,催化合成NADP;(2)濾除所述第一反應液中的固定化NAD激酶,加入葡萄糖配制成第二反應液,向所述第二反應液中加入固定化葡萄糖脫氫酶,催化合成NADPH。2.根據權利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述二價金屬離子為鎂離子,所述NAD、所述偏磷酸鹽和所述鎂離子以1:(1~20):(0.025~2.5)的質量比混和于溶劑中,所述溶劑與所述NAD的質量比為(10~100):1,形成所述第一反應液。3.根據權利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述固定化NAD激酶與所述NAD的質量比為(1~20):1。4.根據權利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述NADP合成的反應條件為:調節pH為4~8,在25℃~55℃的溫度下反應10~40小時。5.根據權利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,按照所述葡萄糖與所述NAD的摩爾比為(0.1~5):1加入所述葡萄糖后,補充加入溶劑,至所述溶劑與所述NAD的質量比為(10~100):1,形成所述第二反應液。6.根據權利要求1或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述固定化葡萄糖脫氫酶與所述NAD的質量比為(0.1~5):1。7.根據權利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述NADPH合成的反應條件為:調節pH為6~9,在5℃~35℃的溫度下反應至pH保持穩定。8.根據權利要求2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述溶劑為純化水或包括磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉中至少一種的水溶液。9.根據權利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,還包括將所述NAD激酶和葡萄糖脫氫酶固定化的方法:a. 將酶載體用質量濃度為1-3%的戊二醛活化后過濾,作為固定化載體;b. 分別將固定化載體加入NAD激酶和葡萄糖脫氫酶的酶液中,調節pH為5~9,在10℃~30℃下緩慢攪動,固定18~36小時得到固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脫氫酶。10.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述NAD激酶與所述酶載體的質量為比1:5,所述葡萄糖脫氫酶與所述酶載體的質量為比1:5。11.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,固定所述NAD激酶的酶載體為LX-1000HFA,固定所述葡萄糖脫氫酶的酶載體為LX-1000NH。12.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,還包括NAD激酶和葡萄糖脫氫酶的制備方法:1)分別發酵培養所述NAD激酶的生產菌和所述葡萄糖脫氫酶的生產菌,發酵結束后收集菌體,將收集的菌體破碎后得到NAD激酶的粗酶液和葡萄糖脫氫酶的粗酶液;2)將步驟1)中得到的粗酶液進行絮凝,然后過濾所述粗酶液,得到純化的NAD激酶的酶液和葡萄糖脫氫酶的酶液。13. 根據權利要求12所述的固定化酶催化合成NADPH的方法,其特征在于,所述NAD激酶的生產菌為克隆有SEQ ID NO.1所示基因的大腸桿菌基因工程菌,所述葡萄糖脫氫酶的生產菌為克隆有SEQ ID NO.2所示基因的大腸桿菌基因工程菌。
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專利技術附圖

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