本發(fā)明涉及一種利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方法。包括以下步驟：1）采集人體外周血樣品，2）體外分離純化獲得DNT細(xì)胞，3）體外培養(yǎng)DNT細(xì)胞，4）洗滌、收集DNT細(xì)胞，其特征在于：所述的步驟3）依次在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，再加上1~10v%的AB血清、1~10v%的自體血漿或1~10v%的人血白蛋白中的一種或多種作為添加蛋白成分。本發(fā)明所述方法安全、高效、經(jīng)濟(jì)、可產(chǎn)業(yè)化、可用于臨床應(yīng)用。

1.一種利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血 DNT 細(xì)胞的方法，依次包括以
下步驟 ：1）將人體外周血樣品進(jìn)行處理；2）體外分離純化獲得 DNT 細(xì)胞；3）體外培養(yǎng) DNT
細(xì)胞，具體過程為 ： 0~3 天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶已用 1~10 μg/ml 的抗人 CD3 單克
隆抗體包 被，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加 50~200 單位 /ml 的慶大霉素、100~1000 IU/
ml 的重組人 白介素 2、1~5 ng/ml 的重組人白介素 4 、1~20ng/ml 的重組人白介素 7 、
1~20 ng/ml 的重 組人白介素 12、1 ~10v% 的自體血漿和 1 ~10v% 的 AB 血清 ； 3~7
天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加 50~200 單位 /ml 的慶大霉素、 100~
1000 IU/ml 的重組人白介素 2 、1~5 ng/ml 的重組人白介素 4 、1~20 ng/ml 的重組人
白介素 7、1~20 ng/ml 的重組人白介素 12 、1 ~5v% 的自體血漿和 1 ~10v% 的 AB 血清
； 7~10 天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加 50~200 單位 /ml 的慶大霉素、
100~1000 IU/ml 的重組人白介素 2 、1~5 ng/ml 的重組人白介素 4 、50~200 ng/ml 的
可溶 性抗人 CD3 單克隆抗體、1~20 ng/ml 的重組人白介素 12、1 ~10v% 的自體血漿和
1 ~10v% 的 AB 血清 ； 10~20 天在培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加 50~200
單位 /ml 的慶大霉素、 100~1000 IU/ml 的重組人白介素2、1~5 ng/ml 的重組人白介素
4、50~200 ng/ml 的可溶性 抗人 CD3 單克隆抗體、1~20 ng/ml 的重組人白介素 12、1 ~
10v% 的人血白蛋白和 1 ~10v% 的 AB 血清；4）洗 滌、收集 DNT 細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方
法，其特征在于 ：所述的步驟 4）之后重懸 DNT 細(xì)胞，將收集到的 DNT 細(xì)胞加入 0.9w%
的生理 鹽水袋中，并添加 100~1000 IU/ml 的重組人白介素 2 和 1 ~5v% 的人血白蛋
白。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血 DNT 細(xì)胞
的方法，其特征在于 ：所述的無動物血清培養(yǎng)基為 Life Technology 公司的 AIM-V 培養(yǎng)
基、寶 日醫(yī)公司的 GT-T551 培養(yǎng)基、日本細(xì)胞科學(xué)研究所的 ALyS505N 培養(yǎng)基、德國
Pan-biotech 公司的 PANSERIN701 培養(yǎng)基、美國 LONZA 公司的 X-VIVO10 培養(yǎng)基或美國
LONZA 公司的 X-VIVO15 培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方
法，其特征在于 ：所述的 0~7 天，無動物血清培養(yǎng)基選用 AIM-V 培養(yǎng)基、X-VIVO10 培養(yǎng)
基或 X-VIVO15 培養(yǎng)基 ；10 天 ~20 天，無動物血清培養(yǎng)基選用 PANSERIN701 培養(yǎng)基、
GT-T551 培養(yǎng)基或 ALyS505N 培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血 DNT 細(xì)胞
的方法，其特征在于 ：所述的步驟 4）中采用尖底離心瓶收集 DNT 細(xì)胞，接著離心處理，然
后用 0.9w% 的生理鹽水洗滌，再離心處理。