1.一種食品紅10檢測試劑盒,其特征在于,主要包括:
1)包被食品紅10特異性抗原的酶標板:所述酶標板的每個微孔內食品紅
10特異性抗原的濃度為1-3μg/mL;
2)食品紅10特異性抗體溶液:該食品紅10特異性抗體的濃度為1-3μg/mL;
所述食品紅10特異性抗原與食品紅10特異性抗體溶液的用量比為1:1;
所述包被食品紅10特異性抗原的酶標板通過以下方法制備:將食品紅10
和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中,零攝氏度下加入甲磺酰氯作為活化試劑,室
溫攪拌,食品紅10的醇羥基可轉化成甲磺酯基;隨后將甲磺酯化食品紅10加
入無水乙醇中,加入液氨,回流攪拌h,制得能夠與蛋白質偶聯的食品紅10的
半抗原;再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合,再與牛血清白蛋白混合,
室溫攪拌,偶聯制備得到食品紅10特異性抗原;將食品紅10特異性抗原包被
于酶標板中,即得;
所述食品紅10特異性抗體通過以下方法制備:以上述合成的食品紅10特
異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫;免疫后,取血清效價高的小鼠,取其脾
細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合;采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,得
到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株;并取不完全佐劑腹腔
注射進行致敏后的小鼠,將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中,收集腹水,
經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化,得到純化的食品紅10單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的食品紅10檢測試劑盒,其特征在于,還包括有
酶標二抗,所述酶標二抗是濃度按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記羊
抗鼠二抗。
3.根據權利要求1或2所述的食品紅10檢測試劑盒,其特征在于,所述
食品紅10特異性抗原的濃度為2μg/mL;所述食品紅10特異性抗體的濃度為2
μg/mL。
4.根據權利要求1所述的食品紅10檢測試劑盒,其特征在于,還包括食
品紅10標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。
5.根據權利要求4所述的食品紅10檢測試劑盒,其特征在于,所述食品
紅10特異性抗體是鼠源單克隆抗體;所述食品紅10特異性抗原為食品紅10與
載體蛋白的偶聯物;所述載體蛋白為牛血清白蛋白;所述食品紅10標準品溶液
濃度分別為1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、1×100
μg/L;所述顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成,所述顯色劑A為過氧化氫或過
氧化脲,所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺;所述終止液為1-2mol/L的
硫酸溶液;所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M,pH7.4的磷酸鹽緩
沖液;所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M,pH7.4的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮
樣品稀釋液為0.01M,pH7.4的磷酸鹽緩沖液;所述酶標板的材料為聚苯乙烯、
聚乙烯、聚丙烯中的一種。
6.一種食品紅10檢測試劑盒制備方法,其特征在于,主要包括以下步驟:
1)制備包被食品紅10特異性抗原的酶標板:將食品紅10和三乙胺分散于
干燥二氯甲烷中,零攝氏度下加入甲磺酰氯作為活化試劑,室溫攪拌,食品紅
10的醇羥基可轉化成甲磺酯基;隨后將甲磺酯化食品紅10加入無水乙醇中,加
入液氨,回流攪拌h,制得能夠與蛋白質偶聯的食品紅10的半抗原;再將其與
N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合,再與牛血清白蛋白混合,室溫攪拌,偶聯制
備得到食品紅10特異性抗原;將食品紅10特異性抗原包被于酶標板中,所述
酶標板的每個微孔內食品紅10特異性抗原的濃度為1-3μg/mL;
2)制備食品紅10特異性抗體:以步驟1)中合成的食品紅10特異性抗原
作為免疫原對小鼠進行免疫;免疫后,取血清效價高的小鼠,取其脾細胞與骨
髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合;采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,得到完全同
質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株;并取不完全佐劑腹腔注射進行
致敏后的小鼠,將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中,收集腹水,經辛酸-硫
酸銨沉淀法進行腹水純化,得到純化的食品紅10單克隆抗體;所述食品紅10
特異性抗體的濃度為1-3μg/mL。
7.根據權利要求6所述的食品紅10檢測試劑盒制備方法,其特征在于,
步驟1)中,制備食品紅10特異性抗原的具體方法為:將0.87g食品紅10和
1.01g三乙胺分散于100mL干燥二氯甲烷中,零攝氏度下加入0.5mL甲磺酰氯作
為活化試劑,室溫攪拌3.5h,食品紅10的醇羥基可轉化成甲磺酯基;隨后將
甲磺酯化食品紅10加入無水乙醇中,加入20倍量的液氨,回流攪拌5h,制得
能夠與蛋白質偶聯的食品紅10的半抗原;再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺
混合,再與牛血清白蛋白混合,室溫攪拌1h,偶聯制備得到食品紅10特異性抗
原。
8.根據權利要求6所述的食品紅10檢測試劑盒制備方法,其特征在于,
步驟2)為:以步驟1)中合成的食品紅10特異性抗原作為免疫原對10周齡的
Balb/c小鼠進行免疫;首次免疫使用完全弗氏佐劑與食品紅10特異性抗原溶液
乳化,抗原濃度為0.4mg/mL,劑量為120μg/只,以后每次加強免疫使用不完
全弗氏佐劑與食品紅10特異性抗原溶液乳化,劑量同初次免疫;初次免疫兩周
后,每間隔10天加強免疫一次,共免疫5-10次,當抗體效價不再升高時,進
行最后一次免疫,最后一次不加免疫佐劑直接用食品紅10特異性抗原水溶液腹
腔注射,劑量同初次免疫;尾部取血檢測血清效價;取血清效價高的小鼠,在
無菌條件下,取其脾細胞按6:1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合;采用
有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交
瘤細胞株;并取Balb/c小鼠,于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏,劑
量為0.5mL/只;將細胞濃度為1.5萬/mL的雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔
中,劑量為0.5mL/只;接種雜交瘤細胞7~10天后,收集腹水,反復收集數次;
存于4℃冰箱保存;經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化,得到純化的食品紅10
單克隆抗體。
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