本發明涉及一種用于分枝桿菌菌種鑒定的雙標記探針檢測和溶解曲線分析方法，以及利用所述方法同時鑒定多種分枝桿菌的試劑盒。本發明中的試劑盒包括針對分枝桿菌16S rRNA基因設計的引物和能夠鑒定分枝桿菌菌種的雙標記寡核苷酸探針，以及一種熱穩定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。本發明中的檢測方法和試劑盒能檢測和/或鑒定24種常見分枝桿菌。根據探針與不同菌種的序列雜交產生不同Tm值的熔解峰判讀結果，可同時快速、準確地檢測分枝桿菌，鑒別分枝桿菌與非分枝桿菌及結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌，鑒定分枝桿菌菌種，3-4小時即可報告結果，從而輔助臨床診斷、指導臨床開展早期有效的化療。

1.一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中鑒別試劑I包括兩對引物和三條探針，所述兩對引物包括引物TBleft1、TBleft2、TBright1和TBright2，其中TBleft1和TBright2分別為上游和下游外圍引物，TBleft2和TBright1分別為內部上游和下游引物，引物TBleft1、TBleft2、TBright1和TBright2的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4所示；所述三條探針TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3位于兩條內部引物之間的多變區，其5’端用報告熒光染料標記，3’端用淬滅熒光染料標記，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15所示。2.權利要求1所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中進一步包括鑒別II，鑒別試劑II中包括兩組，第一組包括兩對引物和兩條探針，所述兩對引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4，其中TBleft3和TBright4分別為上游和下游外圍引物，TBleft4和TBright3分別為內部上游和下游引物，引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8所示，所述兩條探針TBProbe4、TBProbe6位于兩條內部引物之間的多變區，其5’端用報告熒光染料標記，3’端用淬滅熒光染料標記，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：18所示；第二組包括另外兩對引物和一條探針，所述兩對引物包括引物TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其中TBleft5和TBright6分別為上游和下游外圍引物，TBleft6和TBright5分別為內部上游和下游引物，引物TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:9、SEQ?ID?NO:10、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:12?所示；所述一條探針TBProbe5位于兩條內部引物之間的多變區，其5’端用報告熒光染料標記，3’端用淬滅熒光染料標記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:17所示。3.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的報告熒光染料選自FAM、ROX、HEX或JOE。4.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的淬滅熒光染料選自BHQ1、BHQ2、Eclipse或TAMRA。5.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbe1的5’端用報告熒光染料FAM標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ1標記；TBProbe2的5’端用報告熒光染料HEX標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ1標記；TBProbe3的5’端用報告熒光染料ROX標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ2標記。6.權利要求2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbe4的5’端用報告熒光染料FAM標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ1標記；TBProbe5的5’端用報告熒光染料ROX標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ2標記；TBProbe6的5’端用報告熒光染料HEX標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ1標記。7.權利要求2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的分枝桿菌為臨床常見的結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M.simiae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、海分枝桿菌(M.marinum)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、不產色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、愛知分枝桿菌(M.aichiense)、鳥分枝桿菌(M.avium)、迪氏分枝桿菌(M.diernhoferi)、次要分枝桿菌(M.triviale)、偶然分枝桿菌(M.fortuitum)、土地分枝桿菌(M.terrae)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)、龜分枝桿菌龜亞種(M.chelonae?subsp.chelonae)、龜分枝桿菌膿腫亞種(M.chelonae?subsp.abscessus)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistibile)、田野分枝桿菌(M.agri)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、?草分枝桿菌(M.phlei)。8.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，進一步還包括熱穩定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列擴增所需的其它各種試劑。9.權利要求1至8中任一項所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒在制備用于鑒定分枝桿菌的產品的用途。?