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一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法

  • 專利類型:發(fā)明專利
  • 有效期:不限
  • 發(fā)布日期:2021-12-22
  • 技術(shù)成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態(tài)核實
  • 簽署交易協(xié)議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(shù)(專利)類型 發(fā)明專利
  • 申請?zhí)?專利號 CN201310466109.X 
  • 技術(shù)(專利)名稱 一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法 
  • 項目單位 武漢百泰基因工程有限公司
  • 發(fā)明人 葉倫,林佳,李品 
  • 行業(yè)類別
  • 技術(shù)成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯(lián)系人 錢怡伽
  • 發(fā)布時間 2021-12-22  
  • 01

    項目簡介

    本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,公開了一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑,利用鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列,從而提高sanger測序法的靈敏度和BRAF基因突變的檢出率。本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全,不需要較多昂貴試劑的使用,經(jīng)濟高效;同時還具有操作時間短的優(yōu)點,整個檢測過程可在4~6小時內(nèi)完成。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒,其特征在于,包括PCR反應(yīng)
    液、PNA試劑、酶消化液、測序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液,所述PCR反應(yīng)液
    包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合
    酶,所述PCR正向引物的序列為SEQ.ID?NO.1,所述PCR反向引物的序列為
    SEQ.ID?NO.2,所述探針的序列為SEQ.ID?NO.3,所述探針的5’端的熒光基團為
    FAM,3’端的熒光基團為BHQ1;所述PNA的序列為SEQ.ID?NO.4;所述測序
    反應(yīng)液包含Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。
    2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述PCR緩沖液由100mmol/L?
    Tris-HCl、500mmol/L?KCl和15mmol/L?MgCl2組成;所述dNTPs的摩爾濃度為
    2.5mmol/L?dNTPs;所述PCR正向引物的摩爾濃度為10μmol/L,所述PCR反向
    引物的摩爾濃度為10μmol/L;所述探針的摩爾濃度為10μmol/L;所述DNA聚
    合酶的酶活力單位濃度為5U/μl;所述PNA試劑的摩爾濃度為10μmol/L。
    3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ
    和堿性磷酸酶。
    4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒,其特征在于,所述核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶
    的酶活力單位比為5:2。
    5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述測序反應(yīng)液含有5×Bigdye、
    2.5×Bigdye緩沖液和3μmol/L的測序引物。
    6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶
    液。
    7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于在所述PCR正向引物的5’端
    插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT,在所述PCR反向引物的5’
    端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC,則所述的測序引物序列為:
    TGTAAAACGACGGCCAGT。
    8.一種權(quán)利要求1~7任一所述試劑盒用于非診斷用途的BRAF基因熱點突變的
    檢測方法,其特征在于它包括如下步驟:
    (1)目的基因熒光定量PCR擴增:使用試劑盒中的PCR反應(yīng)液和PNA試劑,
    對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng),得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物;
    (2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果,使用試劑盒中的酶消化液,對步驟(1)
    得到的PCR產(chǎn)物進行純化,得到純化后PCR產(chǎn)物;
    (3)使用試劑盒中的測序反應(yīng)液,對步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進行測
    序PCR反應(yīng),得到測序PCR產(chǎn)物;
    (4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液,對步驟(3)得到的測序PCR產(chǎn)物進
    行純化,得到純化后測序PCR產(chǎn)物;
    (5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產(chǎn)物加樣至測序儀進行序列分析,測
    序所得基因序列與BRAF基因標準序列進行比對,判斷是否存在BRAF基因熱
    點突變。
    展開

專利技術(shù)附圖

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