本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，利用鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列，從而提高sanger測序法的靈敏度和BRAF基因突變的檢出率。本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全，不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟高效；同時還具有操作時間短的優(yōu)點，整個檢測過程可在4～6小時內(nèi)完成。

1.一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)
液、PNA試劑、酶消化液、測序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液
包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合
酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.ID?NO.1，所述PCR反向引物的序列為
SEQ.ID?NO.2，所述探針的序列為SEQ.ID?NO.3，所述探針的5’端的熒光基團為
FAM，3’端的熒光基團為BHQ1；所述PNA的序列為SEQ.ID?NO.4；所述測序
反應(yīng)液包含Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由100mmol/L?
Tris-HCl、500mmol/L?KCl和15mmol/L?MgCl₂組成；所述dNTPs的摩爾濃度為
2.5mmol/L?dNTPs；所述PCR正向引物的摩爾濃度為10μmol/L，所述PCR反向
引物的摩爾濃度為10μmol/L；所述探針的摩爾濃度為10μmol/L；所述DNA聚
合酶的酶活力單位濃度為5U/μl；所述PNA試劑的摩爾濃度為10μmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ
和堿性磷酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶
的酶活力單位比為5：2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述測序反應(yīng)液含有5×Bigdye、
2.5×Bigdye緩沖液和3μmol/L的測序引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶
液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端
插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’
端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測序引物序列為：
TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一種權(quán)利要求1～7任一所述試劑盒用于非診斷用途的BRAF基因熱點突變的
檢測方法，其特征在于它包括如下步驟：
(1)目的基因熒光定量PCR擴增：使用試劑盒中的PCR反應(yīng)液和PNA試劑，
對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；
(2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟(1)
得到的PCR產(chǎn)物進行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物；
(3)使用試劑盒中的測序反應(yīng)液，對步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進行測
序PCR反應(yīng)，得到測序PCR產(chǎn)物；
(4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液，對步驟(3)得到的測序PCR產(chǎn)物進
行純化，得到純化后測序PCR產(chǎn)物；
(5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產(chǎn)物加樣至測序儀進行序列分析，測
序所得基因序列與BRAF基因標準序列進行比對，判斷是否存在BRAF基因熱
點突變。