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CMPF均相酶免疫檢測試劑盒、制備方法及檢測方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-09-02
  • 技術成熟度:已有樣品
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201811518946.1 
  • 技術(專利)名稱 CMPF均相酶免疫檢測試劑盒、制備方法及檢測方法 
  • 項目單位 杭州博譜醫藥科技有限公司
  • 發明人 朱永良,王軼雄,程小龍 
  • 行業類別 藥品-生物藥品
  • 技術成熟度 已有樣品
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 陳詠艷
  • 發布時間 2021-09-02  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種CMPF均相酶免疫檢測試劑盒、制備方法及檢測方法,試劑盒的CMPF抗體的免疫原由CMPF與蛋白質或多聚賴氨酸偶聯物作為免疫原進行免疫獲得。分別利用CMPF支鏈末端的?COOH與蛋白質或多聚賴氨酸分子上的?NH2進行偶聯;接著利用這些偶聯物免疫物作為免疫原進行免疫小鼠或家兔,最后獲得特異性的抗CMPF的單克隆或多克隆抗體;并基于該抗CMPF的單克隆或多克隆抗體建立CMPF含量檢測方法;該檢測方法可在生化分析儀等大型自動化儀器上進行大樣本自動化檢測分析。檢測方法具有檢測靈敏度高,特異性強,檢測重復性高和穩定性好等優點,本發明方法檢測靈敏度0.5μg/L。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種CMPF均相酶免疫檢測試劑盒,其特征在于,包括試劑R1、試劑R2和標準品溶液,所述試劑R1由如下組分和含量組成:磷酸鹽緩沖液 50-200mM,CMPF抗體 5-500mg/L,NAD輔酶 1-10mM,G-6-P-Na2 3-20mM,表面活性劑 0.01-10g/L,穩定劑 0.1-0.5g/L;所述試劑R2由如下組分和含量組成:磷酸鹽緩沖液 50-200mM,G6PDH-CMPF偶聯物 5-500U/L,BSA 0.01-10g/L,表面活性劑 0.01-10g/L;所述標準品溶液,其由CMPF與校準品稀釋液梯度稀釋而成,所述標準品稀釋液由如下組分和含量組成:磷酸鹽緩沖液 0.05-0.2M,BSA 0.01-10g/L,穩定劑 0.1-0.5g/L;其中G6PDH-CMPF偶聯物的制備,包括如下步驟:稱取100 mgCMPF,用10ml二甲亞楓溶解,10KU葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,溶解于200mlpH7.3,100mM的磷酸鹽緩沖液中,室溫攪拌15分鐘,再加入25 mg水溶性碳二亞胺粉末,室溫避光溫和攪拌180分鐘,裝入透析袋,自由通透分子大小<14KD,置4℃透析,每6小時換液1次,連續6-8次;用超濾膜包對透析液進行濃縮,濃縮體積至30ml,上G200凝膠層析柱3.0×50cm分離產物,收集G6PDH-CMPF峰,共收集80ml,對純化水透析3次,冷凍干燥,得到4.7KU的G6PDH-CMPF;其中抗CMPF的特異性鼠源性單克隆IgG型抗體的制備,包括如下步驟:S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備將CMPF與載體蛋白質混合,并加入碳二亞胺,在碳二亞胺作用下,CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應,然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物;或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替,得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物;S2.動物免疫以CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物/次/只小鼠的濃度與等量的完全福氏佐劑混勻,皮下多點注射免疫Balb/c雌性小鼠,第1次與第2次間隔10-14天,以后每次間隔7天,連續5次,第2-5次CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物與等量的不完全福氏佐劑乳化混勻,間隔1周后采用尾靜脈/腹腔注射無菌的CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物,以加強免疫1次,3天后細胞融合;S3.雜交瘤細胞的制備取步驟S2免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按體積比1:6在50%PEG的作用下融合,融合細胞先在次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶選擇培養基中,在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養,2周后換為次黃嘌呤-胸腺嘧啶培養基,繼續在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養;待克隆孔長至1/3-1時,取培養上清液進行抗體檢測篩選;S4.特異性克隆孔篩選用50 mM的碳酸鹽緩沖液稀釋CMPF-蛋白質偶聯物至100L/孔包被反應微孔4℃過夜或37℃120 min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,用10%小牛血清室溫封閉30min,再加入100μl上述步驟S3培養上清液室溫反應60min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,最后再加入1:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP室溫反應60min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,加入四甲基聯苯氨底物顯色觀察;凡出現明顯藍色反應者為陽性,否則為陰性;保留與CMPF-蛋白質偶聯物有反應的細胞克隆孔,再采用有限稀釋法進行3次克隆篩選,建株的雜交瘤細胞再擴大培養、凍存,用于制備腹水;S5.腹水的制備和純化將穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞擴大培養后,以0.5×104-5×105個/只接種到預先用0.5 mL降植烷或液體石蠟致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔,7-12天內觀察,收取腹水,離心后測定效價;經50%飽和硫酸銨沉淀保存或者低溫凍存;腹水采用50%飽和硫酸銨沉淀-正辛酸沉淀,或者用50%飽和硫酸銨沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow親和層析純化,最后用SDS-PAGE檢測純度,需達到90%,獲得抗CMPF-蛋白質偶聯物特異性單克隆抗體;其中抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗體的制備,包括如下步驟:S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備將CMPF與載體蛋白質混合,并加入碳二亞胺,在碳二亞胺作用下,CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應,然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物;或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替,得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物;S2.動物免疫以10 mg CMPF-蛋白質偶聯物/次/只與等量完全福氏佐劑混勻,家兔皮下多點注射免疫,每1-2周1次,連續5次,間隔1周后采用分離頸動脈,收集血液80-120毫升,室溫放置2小時,4℃10000 rpm離心30min,分離收集血清;上述血清再用CMPF-蛋白質偶聯物,親和層析柱純化抗CMPF的特異性IgG型抗體,最后用8% SDS-PAGE檢測純度,需達到90%;獲得兔源性多克隆IgG抗體;上述純化的兔源性多克隆IgG抗體進一步在pH4.5的50mM醋酸鹽緩沖液中用質量比0.1%的胃蛋白酶切除IgG的Fc'端,37℃反應12小時,然后在調或不調pH值的情況下,用飽和硫酸銨和/或SPA和/或CMPF-蛋白質偶聯物親和層析方法純化F(ab') 2抗體片段;獲得特異性的抗CMPF的F(ab')2特異性抗體片段。2.根據權利要求1所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述CMPF抗體為抗CMPF的特異性鼠源性單克隆IgG型抗體或抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗體,所述特異性鼠源性單克隆IgG型抗體包括IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgG4型抗體;所述兔源性多克隆IgG抗體包含F(ab')2特異性抗體片段。3.根據權利要求2所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述載體蛋白質為BSA、OVA、KLH中的一種或多種。4.根據權利要求3所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。5.根據權利要求4所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述所述表面活性劑為Triton X-100、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一種或多種,所述穩定劑為甘露醇、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000中的一種或多種。6.一種權利要求5所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,其中抗CMPF的特異性鼠源性單克隆IgG型抗體的制備,包括如下步驟:S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備將CMPF與載體蛋白質混合,并加入碳二亞胺,在碳二亞胺作用下,CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應,然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物;或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替,得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物;S2.動物免疫以CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物/次/只小鼠的濃度與等量的完全福氏佐劑混勻,皮下多點注射免疫Balb/c雌性小鼠,第1次與第2次間隔10-14天,以后每次間隔7天,連續5次,第2-5次CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物與等量的不完全福氏佐劑乳化混勻,間隔1周后采用尾靜脈/腹腔注射無菌的CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物,以加強免疫1次,3天后細胞融合;S3.雜交瘤細胞的制備取步驟S2免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按體積比1:6在50%PEG的作用下融合,融合細胞先在次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶選擇培養基中,在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養,2周后換為次黃嘌呤-胸腺嘧啶培養基,繼續在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養;待克隆孔長至1/3-1時,取培養上清液進行抗體檢測篩選;S4.特異性克隆孔篩選用50 mM的碳酸鹽緩沖液稀釋CMPF-蛋白質偶聯物至100L/孔包被反應微孔4℃過夜或37℃120 min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,用10%小牛血清室溫封閉30min,再加入100μl上述步驟S3培養上清液室溫反應60min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,最后再加入1:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP室溫反應60min,用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次,加入四甲基聯苯氨底物顯色觀察;凡出現明顯藍色反應者為陽性,否則為陰性;保留與CMPF-蛋白質偶聯物有反應的細胞克隆孔,再采用有限稀釋法進行3次克隆篩選,建株的雜交瘤細胞再擴大培養、凍存,用于制備腹水;S5.腹水的制備和純化將穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞擴大培養后,以0.5×104-5×105個/只接種到預先用0.5 mL降植烷或液體石蠟致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔,7-12天內觀察,收取腹水,離心后測定效價;經50%飽和硫酸銨沉淀保存或者低溫凍存;腹水采用50%飽和硫酸銨沉淀-正辛酸沉淀,或者用50%飽和硫酸銨沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow親和層析純化,最后用SDS-PAGE檢測純度,需達到90%,獲得抗CMPF-蛋白質偶聯物特異性單克隆抗體。7.一種權利要求5所述的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,其中抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗體的制備,包括如下步驟:S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備將CMPF與載體蛋白質混合,并加入碳二亞胺,在碳二亞胺作用下,CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應,然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物;或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替,得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物;S2.動物免疫以10 mg CMPF-蛋白質偶聯物/次/只與等量完全福氏佐劑混勻,家兔皮下多點注射免疫,每1-2周1次,連續5次,間隔1周后采用分離頸動脈,收集血液80-120毫升,室溫放置2小時,4℃10000 rpm離心30min,分離收集血清;上述血清再用CMPF-蛋白質偶聯物,親和層析柱純化抗CMPF的特異性IgG型抗體,最后用8% SDS-PAGE檢測純度,需達到90%;獲得兔源性多克隆IgG抗體;上述純化的兔源性多克隆IgG抗體進一步在pH 4.5的50mM醋酸鹽緩沖液中用質量比0.1%的胃蛋白酶切除IgG的Fc'端,37℃反應12小時,然后在調或不調pH值的情況下,用飽和硫酸銨和/或SPA和/或CMPF-蛋白質偶聯物親和層析方法純化F(ab') 2抗體片段;獲得特異性的抗CMPF的F(ab')2特異性抗體片段。8.一種非診斷目的的CMPF含量的檢測方法,其特征在于,采用權利要求6或7的制備方法制備得到的CMPF均相酶免疫檢測試劑盒進行CMPF含量的檢測,包括如下步驟:S1.標準曲線的建立將試劑R1與標準品溶液混合,混合體積比例為10-200:1,恒溫孵育1-10分鐘,加入等體積的試劑R2,在自動生化分析儀或紫外分光光度計上,用340nm波長,測定光密度OD值或吸光度A值,以標準品濃度為橫坐標,光密度OD值或吸光度A值為縱坐標,繪制標準曲線;S2.樣品的測試將試劑R1與樣品混合,樣品體積與標準品溶液一致,恒溫孵育1-10分鐘,加入等體積的試劑R2,在自動生化分析儀或紫外分光光度計上,用340nm波長,測定光密度OD值或吸光度A值;S3.CMPF含量的測定記錄樣品加入后的OD值或吸光度A值,根據標準曲線讀數,得到樣品中CMPF的含量濃度。
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