1.利用探測和標記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號傳導寡核苷酸雜交測定來檢測靶核酸序列內的核苷酸變異的非診斷方法，其中包括：(a)使所述靶核酸序列與上游寡核苷酸以及探測和標記寡核苷酸進行雜交；所述上游寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列；所述探測和標記寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其包含與所述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列；(ii)5’-標記部位，其包含與所述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸變異區別位點，其包含與靶核酸上的核苷酸變異互補的序列；所述核苷酸變異區別位點位于3’-靶向部位的5’-末端部分，所述3’-靶向部位與所述靶核酸序列雜交，所述5’-標記部位不與所述靶核酸序列雜交，所述上游寡核苷酸位于所述探測和標記寡核苷酸的上游，所述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導具有5’核酸酶活性的酶對探測和標記寡核苷酸的切割；(b)在用于切割所述探測和標記寡核苷酸的條件下，使所述步驟(a)的結果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸；其中當所述探測和標記寡核苷酸與具有對所述核苷酸變異區別位點互補的核苷酸變異的靶核酸序列雜交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分與靶核酸序列形成雙鏈而誘導從第一初期切割位置切割時，則放出第一片段；其中當所述探測和標記寡核苷酸與具有對所述核苷酸變異區別位點非-互補的核苷酸變異的靶核酸序列雜交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分不與靶核酸序列形成雙鏈而誘導從位于第一初期切割位置下游的第二初期切割位置進行切割時，則放出第二片段；所述第二片段包含額外的3’-末端部位，這使第二片段與第一片段不同；(c)使從所述探測和標記寡核苷酸放出的所述片段與捕捉和模板化寡核苷酸進行雜交；所述捕捉和模板化寡核苷酸沿著3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含與所述探測和標記寡核苷酸的5’-標記部位互補的核苷酸序列或者與5’-標記部位的一部分互補的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含分別與所述探測和標記寡核苷酸的5’-標記部位以及3’-靶向部位非-互補的核苷酸序列；從所述探測和標記寡核苷酸放出的第一片段或第二片段與所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；(d)利用模板-依賴性核酸聚合酶及所述步驟(c)的結果物來實施延伸反應；若所述第一片段與捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交，則所述第一片段被延伸，來生成包含與所述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互補的延伸序列的延伸鏈，若所述第二片段與捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交，則不被延伸；(e)使所述延伸鏈與信號傳導寡核苷酸雜交的步驟；所述信號傳導寡核苷酸包含與所述延伸鏈互補的序列以及至少一個標記，且所述信號傳導寡核苷酸與所述延伸鏈雜交來提供能夠檢測的信號；以及(f)檢測所述信號；所述信號的檢測表示與所述探測和標記寡核苷酸的核苷酸區別部位互補的核苷酸變異的存在。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號傳導寡核苷酸的至少一部分包含與所述延伸序列互補的序列。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述能夠檢測的信號是由(i)與所述信號傳導寡核苷酸相結合的標記；(ii)與所述信號傳導寡核苷酸相結合的標記及與從所述探測和標記寡核苷酸放出的片段相結合的標記的組合；(iii)與所述信號傳導寡核苷酸相結合的標記及在步驟(d)的延伸過程中摻入于所述延伸鏈的標記的組合；或(iv)與所述信號傳導寡核苷酸相結合的標記以及嵌入染料的組合來提供。4.根據權利要求1所述的方法，其中所述捕捉和模板化寡核苷酸的序列被選擇為，所述捕捉和模板化寡核苷酸不與第二片段的額外的3’末端部分雜交，以防止第二片段與所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部分雜交時第二片段發生延伸。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸變異區別位點位于與所述探測和標記寡核苷酸的3’靶向部分的5’－末端間隔10個核苷酸的范圍內。6.根據權利要求1所述的方法，其中所述探測和標記寡核苷酸的3’靶向部分的5’末端部分包含位于從所述核苷酸變異區別位點隔開1－5個核苷酸范圍內的非-堿基配對部分，其中非-堿基配對部分增強第一初期切割位置和第二初期切割位置之間的區分。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述非-堿基配對部分擴大第一初期切割位置及第二初期切割位置之間的距離。8.根據權利要求6所述的方法，其中所述非-堿基配對部分是：(ⅰ)包含人為錯配堿基、變形為無法堿基配對的非-堿基對堿基或通用堿基的核苷酸，(ⅱ)變形為無法堿基配對的非-堿基對核苷酸或者(ⅲ)非-堿基對的化合物。9.根據權利要求6所述的方法，其中所述非-堿基對部分具有1～5個部分。10.根據權利要求6所述的方法，其中所述核苷酸變異區別位點及所述探測和標記寡核苷酸的非-堿基對部分位于從3’-靶向部位的5’-末端間隔10個核苷酸的范圍內。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法進一步包括重復實施步驟(a)～步驟(f)中的全部或一部分，并且在各重復循環之間包括變性步驟。12.根據權利要求1所述的方法，其中進行所述方法以檢測至少2種類型的靶核酸序列，其中所述上游寡核苷酸包含至少2種類型的寡核苷酸，所述探測和標記寡核苷酸包含至少2種類型的探測和標記寡核苷酸，所述捕捉和模板化寡核苷酸包含至少2種類型的捕捉和模板化寡核苷酸，所述信號傳導寡核苷酸包含至少2種類型的信號傳導寡核苷酸。13.根據權利要求1所述的方法，其中所述上游寡核苷酸是上游引物，并且步驟(b)使用模板依賴性核酸聚合酶來延伸上游引物，其中所述模板依賴性核酸聚合酶與所述具有5’核酸酶活性的酶相同。14.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在液相中或固相上進行。15.根據權利要求1－14中任一項所述的方法，其中所述方法在有下游引物存在下進行。16.用于通過探測和標記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號傳導寡核苷酸雜交測定來檢測靶核酸序列上的核苷酸變異的試劑盒，其中包含：(a)探測和標記寡核苷酸，其中所述探測和標記寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其包含與所述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列；(ii)5’-標記部位，其包含與所述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸變異區別位點，其包含與靶核酸上的核苷酸變異互補的序列；所述核苷酸變異區別位點位于3’-靶向部位的5’-末端一部分，所述3’-靶向部位與所述靶核酸序列雜交，所述5’-標記部位不與所述靶核酸序列雜交；(b)上游寡核苷酸，所述上游寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列，所述上游寡核苷酸位于所述探測和標記寡核苷酸的上游；所述上游寡核苷酸或者其延伸鏈誘導具有5’核酸酶活性的酶對所述探測和標記寡核苷酸的切割；(c)捕捉和模板化寡核苷酸，所述捕捉和模板化寡核苷酸沿著3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含與所述探測和標記寡核苷酸的所述5’-標記部位互補的核苷酸序列或者與所述5’-標記部位的一部分互補的核苷酸序列；以及(ii)模板化部位，其包含分別與所述探測和標記寡核苷酸的所述5’-標記部位以及3’-靶向部位非-互補的核苷酸序列；其中當所述探測和標記寡核苷酸與具有對所述核苷酸變異區別位點互補的核苷酸變異的靶核酸序列雜交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分與靶核酸序列形成雙鏈而誘導從第一初期切割位置切割時，則放出第一片段；其中當所述探測和標記寡核苷酸與具有對所述核苷酸變異區別位點非-互補的核苷酸變異的靶核酸序列雜交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分不與靶核酸序列形成雙鏈而誘導從位于第一初期切割位置下游的第二初期切割位置進行切割時，則放出第二片段；所述第二片段包含額外的3’-末端部位，這使第二片段與第一片段不同，并且從所述探測和標記寡核苷酸釋放出的第一片段或第二片段與所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部分雜交；和(d)信號傳導寡核苷酸，所述信號傳導寡核苷酸包含與所述延伸鏈互補的序列，以及至少一個標記，其中所述信號傳導寡核苷酸通過與所述延伸鏈雜交來提供能夠檢測的信號。17.根據權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含具有5’核酸酶活性的酶。
展開
