本發明涉及一種重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應用。重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發明采用大腸桿菌生產重組μPlm，通過眼部的玻璃體腔注射μPlm可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強、免疫原性低、副作用小等優點。利用本發明采用大腸桿菌表達系統生產的重組μPlm，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達量高，生產工藝簡便，生產成本低，和表達蛋白活性穩定，制品使用安全等特點。應用本發明可開發出經濟安全，非手術治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術所面臨的費用高、手術難度大和并發癥多等問題。

1.一種利用大腸桿菌表達系統生產重組微纖維蛋白溶酶的方法，其特征在于：包括如
下合成步驟：
（1）將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質粒的大腸桿菌E.coli表
達載體pET11中，然后傳導到大腸桿菌宿主BL21中，并用氨芐青霉素選擇抗性克隆；所述的
編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達、復性以及純化：① 將（1）中選擇的培養攜帶表
達質粒的E.coli抗性克隆在LB/Ampicillin培養基中培養到A₆₀₀=0.6-0.9的生長期；② 加
入IPTG誘導蛋白以包涵體形式表達，37 ^oC下繼續培養3-5小時；③ 離心收獲細菌，然后通
過凍融和漂洗得到純化的包涵體；④ 在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體；所述的尿
素緩沖液中含有20 mM Tris；⑤ 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM
Tris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的緩沖液中，用復性方法將變性蛋白復性成它的天然構象，
得復性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法從部分或全部未折疊的重組微纖維蛋白溶酶原多肽或
它的多聚體中將復性蛋白完全分離出來，所述的分子排阻色譜法包括Superdex 200和
Superdex 75，層析柱緩沖液為20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， 0.2 M NaCl， pH 8.0；⑦ 采
用離子交換和親和層析進一步純化復性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸
序列如SEQ ID NO.2所示；⑧ 分子排阻色譜法純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽進一步用
離子交換柱和疏水柱方法純化；
（3）將純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶，所述
的活化酶是普激酶；
（4）將激活后得到的重組微纖維蛋白溶酶用離子交換柱層析法純化，然后傳入到穩定
緩沖液中儲存，所述的穩定緩沖液包括：20 mM 檸檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。
2.按照權利要求1所述的方法制備的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分在制備治療玻
璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網膜脫離、視網膜撕裂、視網膜新生血管形成、視網膜出
血、視網膜水腫或者處理玻璃體后脫離不完全的手術并發癥藥物中的應用。
3.按照權利要求2所述的應用，其特征在于：重組微纖維蛋白溶酶的用量為：每只眼睛
0.005毫克-0.2毫克。