本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF細菌雙雜交克隆文庫的構建方法及應用。本發明的特征是，制備了一個適用于構建結核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF克隆文庫的細菌雙雜交載體pTRG-MCM△，利用PCR反應獲得結核分枝桿菌H37Rv的全部編碼基因，通過將結核分枝桿菌H37Rv的全部編碼基因精確克隆到本發明構建的細菌雙雜交載體pTRG-MCM△中，轉化大腸桿菌DH10B，得到結核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF細菌雙雜交克隆文庫。

1.一種用于構建結核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF克隆文庫的細菌雙雜交載體pTRG-MCMΔ，其特征在于，它是通過以下步驟獲得的：1)將購于invitrogen公司的細菌雙雜交載體pTRG上211位點的XbaI酶切位點消除：先用XbaI對pTRG載體進行酶切，再用Klenow片段對酶切后線性載體的5’末端進行補平，并將線性載體自連環化，從而將211位點完整的XbaI酶切位點消除，獲得一個中間載體pTRG-XbaIΔ；2)將步驟1)獲得的中間載體pTRG-XbaIΔ用限制性內切酶EcoRI和XhoI進行消化；3)利用極端嗜熱古菌S.solfataricus的微型染色體維持基因MCM作為一個媒介基因，通過PCR的方法獲得兩末端分別含有EcoRI和XhoI酶切位點的MCM媒介基因；4)將步驟3)獲得的MCM媒介基因用限制性內切酶EcoRI和XhoI進行消化；5)將步驟2)獲得的中間載體pTRG-XbaIΔ和步驟4)獲得的MCM媒介基因在16℃的條件下連接過夜，得到中間載體pTRG-MCM；6)將步驟5)獲得的中間載體pTRG-MCM用限制性內切酶BamHI充分酶切；7)將步驟6)酶切后的中間載體pTRG-MCM末端削平并自連接，獲得改造的細菌雙雜交載體pTRG-MCMΔ，其大小為5592bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。其中，步驟3)利用PCR擴增的MCM基因的引物對的序列如下所示：正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC；反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。2.一種構建結核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF克隆文庫的方法，其特征在于步驟如下：1)利用PCR方法獲得結核分枝桿菌H37Rv的全部編碼基因：對結核分枝桿菌H37Rv全部編碼基因內部的酶切位點進行分析，選擇所有編碼基因內部沒有的酶切位點作為引物設計時的酶切位點，在設計引物時將所有基因分為六類，前五類基因分別在上游引物和下游引物中引入EcoRI和XbaI、NotI和XbaI、EcoRI和XhoI、NotI和XhoI、BamHI和XhoI，第六類采用連接頭的方法在接頭內引入EcoRI酶切位點，在下游引物內引入XbaI酶切位點，利用PCR對全部編碼基因進行擴增，利用這種引物設計的PCR方法擴增結核分枝桿菌H37Rv全部編碼基因；2)將分為六類的基因擴增產物混合，分別與相對應的酶切組合制備的pTRG-MCMΔ載體連接，將連接產物脫鹽后電轉化到大腸桿菌DH10B，獲得重組克隆，將含有重組克隆的大腸桿菌混合培養，得到重組質粒。