本發明屬于生物工程技術領域，涉及利用GST表達體系制備的Fertilin Beta胞外段高效價抗體及應用。利用基因工程技術，將Fertilin Beta基因胞外段克隆到原核表達載體中，經酶切鑒定后，用重組質粒轉化大腸桿菌，并IPTG誘導產生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清并用ProteinA/G純化。抗體的效價及特異性采用ELISA和Western blot檢測，并應用免疫熒光檢測了Fertilin Beta蛋白特異性定位于精子頭后部。該抗Fertilin Beta多克隆抗體效價與特異性良好，可以應用于細胞中Fertilin Beta蛋白的檢測并能有效檢出Fertilin Beta蛋白特異性定位于精子頭后部，對于系統研究Fertilin Beta蛋白功能意義重大。

1.原核表達GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗體，其特征在于利用GST表達體系以
Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸對應DNA片段作為特異序列制備的GST-Fertilin Beta融合
蛋白作為抗原免疫動物產生抗血清而獲得，該抗血清中抗GST-Fertilin Beta抗體的滴度高達
1∶1000000，并經過Western blot鑒定該Fertilin Beta抗體具有較好的特異性，其中，341-373
位氨基酸序列為：
Glu Ala Ile His Phe Ser Gly Val Lys Ile Phe Ser Asn Cys Ser
1 6 11
Phe Glu Asp Phe Ala His Phe Ile Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys
16 21 26
Leu His Asn
31
其對應核苷酸序列為：
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60
cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat 99。
2.權利要求1所述的原核表達GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征
在于利用GST表達系統獲得GST-Fertilin Beta融合蛋白，再經免疫兔獲得抗GST-Fertilin Beta
抗血清，具體包括五步：
第一步，PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重組質粒的構建
Fertilin Beta基因全長從Genebank得到，基因序列號為AAC51110.1，以基因組為模
板，上游引物為5’-GAA TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT(含EcoRI酶切位點)；下游：
5’-CTC GAG ATT GTG AAG ACA CTG GGA(含XhoI酶切位點)，擴增得到的片段與
pMD18-T載體連接，將連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α中，在含Amp⁺瓊脂平板上
挑選克隆，以堿裂解法小提重組質粒后，以EcoRI和SalI分別單酶切鑒定；
第二步，原核表達載體pGEX-4T-1的構建
將含有Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸對應DNA片段的pMD18-T質粒經EcoRI
和XhoI雙酶切后，利用回收試劑盒獲得Fertilin Beta基因該區片段，同時用相同的酶處
理質粒pGEX-4T-1，然后將回收的Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸對應DNA片段和
經酶切的載體pGEX-4T-1在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，酶切鑒定重組體，
并且測序進一步確定；
第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的誘導表達和純化
重組質粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta轉化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Amp⁺
培養基中，37℃振搖培養過夜，次日，將培養物按1∶50的比例轉接于含Amp⁺的LB
培養基中，繼續在37℃搖床培養至對數生長中期，在培養液的A600為0.5～0.6時，加
入IPTG至終濃度為0.08mmol/L，不加入IPTG者為陰性對照，置25℃繼續培養4～5h，
離心收集菌體，以SDS-PAGE進行鑒定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表達，并優化表達
條件，進行大量擴增誘導，以5000r/min于4℃離心5min，收集菌體，用60mL冰預冷
的NETN懸浮1L菌液的沉淀，用超聲裂解細菌，再以9600rpm，于4℃離心15min，取
上清，過Glutathione-Sepharose4B柱，先以等體積含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl，
pH＝8.0的洗脫緩沖液1洗脫，收集洗脫液，再以等體積含100mM谷胱甘肽的洗脫緩沖
液2洗兩遍，收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產物；
第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制備及純化
以純化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500μg融合蛋
白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點注射，免疫前取耳靜脈血分
離血清，作為免疫前的血清對照，2wk后進行第1次加強免疫，500μg純化的Fertilin Beta
融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射，之后每隔2wk加強免疫
1次，于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當抗體效價達到
1∶1000000時，頸動脈放血，收集血清，將ProteinA/G sepharose CL-4B填料緩慢裝柱，
平衡柱子后加入經過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結合，即親和層析使
抗體結合在柱子上，經2次洗滌后，加pH2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并
測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血
清用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色鑒定；
第五步，Fertilin Beta抗體的免疫學檢測
用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照，將純化后的
GST-Fertilin Beta抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后采用間接ELISA方法測定抗體的效價，
并采用Western blot方法分析Fertilin Beta抗體特異性，將純化的融合蛋白GST-Fertilin
Beta樣品，經SDS-PAGE分離后再電轉移至硝酸纖維素膜上，以5％脫脂奶粉封閉1h，
依次滴加兔抗Fertilin Beta抗體，室溫2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應
1h、PBS洗滌3次，最后加底物DAB顯色，并拍照。