本發(fā)明提供了一種土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，本發(fā)明的構(gòu)建方法先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA，單鏈cDNA的5’端經(jīng)去磷酸化后與5’端磷酸化修飾的接頭1連接，再將5’端連有接頭的cDNA進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)后的cDNA的3’端與接頭2連接，獲得5’、3’端分別連接有接頭的cDNA，采用與接頭部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得土壤微生物的雙鏈cDNA，將此雙鏈cDNA與克隆載體pMD-18T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得土壤微生物的cDNA文庫(kù)。本發(fā)明構(gòu)建的土壤微生物cDNA文庫(kù)庫(kù)容量較大，可以用來(lái)篩選感興趣的目的基因，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。

1.一種土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于：具體步驟包括如下：（1）土壤微生物總RNA獲得：提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；步驟（1）中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒和MicroSpin?S-400?HR?spin?column進(jìn)行純化；（2）總RNA的逆轉(zhuǎn)錄：上述（1）中獲得的總RNA采用PrimeScript?RT?reagent?Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟為：在反應(yīng)體系中加入2?μl??5×PrimeScript?Buffer，0.5?μl??PrimeScript?RT?Enzyme?Mix?I，0.5?μl??Oligo?dT?Primer?50?μM，2?μl??Random?6?mers?100?μM?和500ng??總RNA，并用RNAase-free?H₂O?補(bǔ)足至終體積10?μl；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:?37℃?15?min，85℃?5?sec；逆轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA用2.5倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積3M的醋酸鈉溶液pH=5.2，于-20℃下沉淀12?h，后于4℃?14000rpm離心10min，離心獲得的沉淀用?1ml?75%的乙醇，于4℃?14000rpm離心洗滌10min，重復(fù)兩次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul無(wú)菌水溶解；（3）cDNA?5’端接頭連接：上述（2）的cDNA?先用Alkaline?Phosphatase進(jìn)行5’的去磷酸化反應(yīng)，具體步驟為：在反應(yīng)體系中加入43ul?cDNA,?5ul?10×Alkaline?Phosphatase?Buffer，2ul?Alkaline?Phosphatase，37℃反應(yīng)30min，反應(yīng)液用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇25?：24?：1抽提1次，4℃?14000rpm離心10min，上清用2.5倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積3M的醋酸鈉溶液pH=5.2，于-20℃下沉淀60min，?后于4℃?14000rpm離心10min，沉淀用1ml?75%的乙醇?于4℃?14000rpm離心洗滌10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul無(wú)菌水溶解；去磷酸化后的cDNA利用DNA連接酶與5’接頭5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5’端經(jīng)磷酸化修飾，于16℃下連接12?h,?連接產(chǎn)物用2.5倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積3M的醋酸鈉溶液pH=5.2，于-20℃下沉淀12h后離心洗滌，用43ul的無(wú)菌水溶解沉淀；(4)?cDNA?3’端接頭連接：將（3）中連有5’接頭的cDNA加入?2ul?T4?Polynucleotide?Kinase,?5ul?10×T4?DNA?Polynucleotide?Kinase?Buffer,?37℃反應(yīng)30min,反應(yīng)體系用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇25?：24?：1抽提1次，4℃?14000rpm離心10min，上清用2.5倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積3M的醋酸鈉溶液pH=5.2，于-20℃下沉淀60min，沉淀用1ml?75%的乙醇，于4℃?14000rpm離心洗滌10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul無(wú)菌水溶解，磷酸化反應(yīng)后的cDNA利用DNA連接酶與3’接頭5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'?于16℃下連接12?h；（5）PCR擴(kuò)增：取1ul上述(4)分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA，用接頭的互補(bǔ)引物P1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'?,?P2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'?進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10×Buffer?5μl，dNTP10mM?2μl，上述引物P1，P2?10μM各2μl，Taq?DNA聚合酶5U/μl?0.3μl，cDNA?1μl，無(wú)菌水37.7μl，共50μl，具體的反應(yīng)參數(shù)為：95℃?1?min，94℃?1?min,?65℃?30sec，72℃?2?min?30sec?30?cycles,?72℃?10min，擴(kuò)增后取1ul作為模板按上述反應(yīng)參數(shù)繼續(xù)二次擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為20；(6)?cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：將(5)中PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD-18?T載體進(jìn)行連接后42℃熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得水稻土壤微生物cDNA文庫(kù)。