本發明公開了一種反式?L?脯氨酸?4?羥化酶基因、酶、載體、工程菌以及在催化L?脯氨酸合成反式?4?羥基?L?脯氨酸中的應用。所述反式?L?脯氨酸?4?羥化酶的酶活達到1654.08U/L，比酶活為82.74U/mg濕細胞；直接收集含酶的菌體細胞作為酶源進行生物轉化，反式?4?羥基?L?脯氨酸的量為24.8mg/L；向反應體系中添加0.8％表面活性劑Nymeen?S215后產量高達176.0mg/L，比同條件下不添加Nymeen?S215時提高了6.36倍；在此基礎上向反應體系中添加5g/L葡萄糖，產物量為329.2mg/L，是不添加葡萄糖時的1.87倍。

1.一種反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID
NO.1所示。
2.一種含權利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因的重組載體。
3.一種由權利要求2所述重組載體構建的重組基因工程菌。
4.一種權利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因在制備反式-4-羥基-L-脯氨酸酶
中的應用，其特征在于所述的應用為：構建含有所述反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因的重組
載體，將所述重組載體轉化到大腸桿菌感受態細胞中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培
養，取培養液分離得到含有反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因的菌體細胞。
5.一種權利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因在催化L-脯氨酸制備反式-4-羥
基-L-脯氨酸中的應用，其特征在于所述的應用為：以含有反式-L-脯氨酸-4-羥化酶基因的
重組工程菌經誘導培養獲得的濕菌體為酶源，以L-脯氨酸為底物，以FeSO₄和α-酮戊二酸為
輔底物、以L-抗壞血酸為抗氧化劑、以pH5.0-7.0、60-240 mM的MES緩沖液為反應介質構成
反應體系，在20~40℃、150rpm條件下反應，反應完全后，將反應液分離純化，得到產物反式-
4-羥基-L-脯氨酸。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述反應體系中，濕菌體的質量用量為20 g/
L，底物初始濃度為0.5-2.0g/L，FeSO₄終濃度為0.1-2.0mM，α-酮戊二酸終濃度為2.0-12.0
mM，L-抗壞血酸終濃度為2.0-10.0 mM。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述反應體系中添加有表面活性劑Nymeen-
S215；所述表面活性劑Nymeen-S215的體積用量以反應體系體積計為0.5-1.5%。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述反應體系中還添加有葡萄糖，所述葡萄糖
終濃度以反應體系體積計為2-10 g/L。
9.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述酶源制備步驟如下：將含有反式-L-脯氨
酸-4-羥化酶基因的重組工程菌接種到含終濃度40μg/mL卡那霉素的LB液體培養基種，37°
C、150rpm培養至OD₆₀₀=0.8-1.0，獲得種子液；將種子液以體積濃度2%的接種量轉入含終濃
度40 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37°C、150rpm條件下培養OD₆₀₀=0.4-0.8，向培養
液中添加終濃度0.5 mM的IPTG，28°C、150rpm誘導培養10h，獲得誘導培養液，將誘導培養液
離心，pH 6.5、80 mM的MES緩沖液洗兩次后收集濕菌體，即為酶源；所述LB液體培養基組成：
酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L， NaCl10g/L，溶劑為水，pH值為7.0。