本發(fā)明涉及用于細(xì)胞外產(chǎn)生游離脂肪酸及其酯的經(jīng)遺傳修飾微生物，其中所述微生物的特征在于改進(jìn)的脂質(zhì)生物合成代謝途徑：例如脂酰-CoA合成酶活性降低，使得微生物能夠利用葡萄糖、淀粉、木質(zhì)纖維素和甘油基底物中的一種或更多種作為碳源過(guò)量產(chǎn)生和分泌脂肪酸酯(生物柴油)進(jìn)入周?chē)囵B(yǎng)基。本發(fā)明還提供了用于細(xì)胞外產(chǎn)生游離脂肪酸及其酯的方法，包括使用所述經(jīng)遺傳修飾微生物和適于所述方法的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

1.一種用于細(xì)胞外產(chǎn)生游離脂肪酸及其酯的經(jīng)遺傳修飾微生物，其中
所述微生物的特征在于：
a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通過(guò)FAA2基因缺失實(shí)現(xiàn)，和
b.乙酰CoA羧化酶的表達(dá)增強(qiáng)，其通過(guò)重組內(nèi)源ACC1基因?qū)崿F(xiàn)，
其中所述基因與異源啟動(dòng)子有效連接，和
c.編碼包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的轉(zhuǎn)基因,
其中所述微生物選自物種：曲霉屬(Aspergillus)、假絲酵母屬
(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、
鐮刀菌屬(Fusarium)、Lindnera、油脂酵母屬(Lipomyces)、紅曲霉屬
(Monascus)、毛霉屬(Mucor)、管囊酵母屬(Pachysolen)、畢赤酵母
屬(Pichia)，根霉屬(Rhizopus)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)，紅
酵母屬(Rhodotorula)、酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬
(Schizosacchromyces)，絲孢酵母屬(Trichosporon)、耶氏酵母屬
(Yarrowia)、和接合酵母屬(Zygosacchromyces)。
2.一種細(xì)胞外產(chǎn)生游離脂肪酸及其酯的方法，其包括步驟：
a.將根據(jù)權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾微生物引入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以產(chǎn)
生培養(yǎng)物；
b.孵育所述培養(yǎng)物，其中對(duì)所述培養(yǎng)物中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基通氧；
c.在步驟(b)后不供應(yīng)氧的情況下進(jìn)一步孵育所述培養(yǎng)物；
d.從所述培養(yǎng)物中回收包含游離脂肪酸及其酯的胞外相；
其中所述微生物為酵母或真菌菌株，所述酵母或真菌菌株的特征還在
于所述微生物的遺傳修飾導(dǎo)致較短鏈長(zhǎng)的脂肪酸及其酯的生產(chǎn)增強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微生物選自熱帶假絲酵母
和嗜鞣管囊酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含選自
葡萄糖、甘油、木糖、水解纖維素和半纖維素、淀粉、糖醇和木聚糖中至
少之一的碳源。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中每升所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含下述
成分或由其組成：
碳源≥50g，硫酸銨5g，生物素20μg，葉酸2μg，肌醇10mg，煙酸
400μg，核黃素200μg，鹽酸吡哆醇400μg，鹽酸硫胺400μg，硼酸500μg，
硫酸銅40μg，碘化鉀100μg，氯化鐵200μg，硫酸錳400μg，鉬酸鈉
200μg，硫酸鋅400μg，磷酸二氫鉀900mg，磷酸氫二鉀200mg，硫酸
鎂500mg，氯化鈉100mg，氯化鈣100mg；
并且其中所述碳源選自葡萄糖、甘油、木糖、水解纖維素和半纖維素、
淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一。
6.酵母或真菌菌株用于細(xì)胞外產(chǎn)生游離脂肪酸及其酯的用途，其中
所述酵母或真菌菌株為具有以下特征的經(jīng)遺傳修飾微生物：
a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通過(guò)FAA2基因缺失實(shí)現(xiàn)，
b.乙酰CoA羧化酶的表達(dá)增強(qiáng)，其通過(guò)重組內(nèi)源ACC1基因?qū)崿F(xiàn)，
其中所述基因與異源啟動(dòng)子有效連接，和
c編碼包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的轉(zhuǎn)基因,
其中所述微生物選自物種：曲霉屬、假絲酵母屬、隱球酵母屬、德巴
利酵母屬、鐮刀菌屬、Lindnera、油脂酵母屬、紅曲霉屬、毛霉屬、管囊
酵母屬、畢赤酵母屬，根霉屬、紅冬孢酵母屬，紅酵母屬、酵母屬，裂殖
酵母屬，絲孢酵母屬、耶氏酵母屬和接合酵母屬，所述微生物的特征在于
所述微生物的所述遺傳修飾導(dǎo)致較短鏈長(zhǎng)的脂肪酸及其酯的生產(chǎn)增強(qiáng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述微生物選自熱帶假絲酵母
和嗜鞣管囊酵母。