1.一種血管內皮生長因子(VEGF)化學發光檢測試劑盒的制備方法，其包括如下步驟：
1)VEGF165的蛋白表達和純化：
從人胎盤cDNA文庫中選取人VEGF165全長序列以pGEX-4T-1作為載體，構建表達載體
pGEX-4T-1/VEGF165；將表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態細胞， 得到穩定和
高效表達菌株；
高效表達菌株經IPTG誘導，表達2小時后，收集菌體，超聲破碎后，加入Sarkosyl，混勻；
將含融合蛋白上清加入Glpgtathione Sepharose 4B凝膠，漂洗后，加入還原型谷胱甘肽洗
脫液洗脫，收集蛋白；
2)小鼠免疫和單克隆抗體制備：
小鼠免疫：選用6-8周齡雌性BALA/c小鼠分三次進行免疫，抗原：使用大腸桿菌來源
VEGF；免疫佐劑使用弗氏佐劑；免疫方式：皮下多點注射及腹腔注射，一次免疫；VEGF抗原
20ug與佐劑充分乳化后皮下多點注射；二次免疫：與一次免疫間隔3周后，VEGF抗原20ug與
佐劑充分乳化后皮下多點注射，避開一次免疫注射點，三次免疫：與二次免疫間隔兩周后，
VEGF抗原20ug與佐劑充分乳化后腹腔注射；
進行細胞融合，并用CLIA方法篩選陽性細胞株，進行克隆化與細胞定珠，選用6-8周齡
雌性BALA/c小鼠腹腔注射107個已定珠的細胞，5-10天取小鼠腹水，腹水離心后取上清；
3)將腹水上清采用proteinG純化柱進行純化：
用20mM PB緩沖液平衡純化柱，加入腹水上樣，用PH2.7 0.1mol甘氨酸鹽酸緩沖液進行
洗脫，用含有PH8.7 1mol tris緩沖液的EP管收集,0.05mM PB透析，濃縮凍存；
4)VEGF-CLIA試劑制備：
包被3.5ug/ml的鏈霉親和素100μl/孔4℃過夜，洗滌5次，加生物素化抗體50μl/孔，再
加入待檢樣品50μl/孔,37℃孵育30min,洗滌5次，加HRP標記抗體100μl/孔，37℃孵育
30min， 洗滌5次，加入底物發光液50μl/孔，避光5min，檢測RLpg值，并通過與校準品比較確
定待測樣品中的VEGF含量，VEGF標準品的最低檢出量不大于10pg/ml。
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