1.一種同時分析多個X-STR基因座的復合擴增方法,其不用于疾病的診斷和治療,其特
征在于:
在一個復合擴增反應體系中同時擴增17個基因座:Amelogenin、DXS6795、DXS9902、
DXS8378、HPRTB、GATA165B12、DXS7132、DXS7424、DXS6807、DXS6803、GATA172D05、DXS6800、
DXS10134、GATA31E08、DXS10159、DXS6789和DXS6810;
將17個基因座分為下述四組:
第一組為DXS6795、DXS9902、DXS8378、和HPRTB;
第二組為Amelogenin、GATA165B12、DXS7132、DXS7424和DXS6807;
第三組為DXS6803、GATA172D05、DXS6800和DXS10134;
第四組為GATA31E08、DXS10159、DXS6789和DXS6810;
針對上述分組在基因座重復序列的側翼分別設計特異性引物,使得基因座組內各個片
段峰值均衡性達到40%以上,引物分為如下組合:
第一組引物為SEQ ID NO:13-14、29-30、27-28、9-10所示;
第二組引物為SEQ ID NO:1-2、5-6、23-24、25-26、19-20所示;
第三組引物為SEQ ID NO:17-18、7-8、15-16、31-32所示;
第四組引物為SEQ ID NO:3-4、33-34、11-12、21-22所示;
每組引物分別由不同熒光素標記,其中基因座被位于該基因座兩側的一對引物擴增,
其中每對引物中有一個引物的5’端進行熒光素標記;
將上述四組基因座復合擴增,根據產物峰高情況調整各基因座引物濃度,使各基因座
峰值整體均衡性達到30%以上。
2.如權利要求1所述同時分析多個X-STR基因座的復合擴增方法,其特征在于,
該復合擴增體系為25μl擴增體系,包括5μl SEQ ID NO:1-34所示的引物混合物、10μl
反應緩沖液和2U~4U的熱啟動Taq DNA聚合酶;所述反應緩沖液包括:50mM KCl,10mM
Tris-HCl,2.0mM MgCl2,0.1mg/ml牛血清白蛋白和0.2mM的dNTP;
采用以下程序進行:
1)制作模板DNA;
2)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,
每25μl擴增體系包括10μl反應緩沖液,5μl引物混合物,0.5μl熱啟動Taq DNA聚合酶,7
μl去離子水,將上述組分配成混合液,混勻后分裝至PCR反應管中,將2.5μl模板DNA加入PCR
反應管中;
按照下面的反應條件設置熱循環儀,將PCR反應管放入熱循環儀中開始擴增基因片段,
95℃保溫11分鐘;94℃保溫30秒鐘,60℃保溫60秒鐘,70℃保溫60秒鐘,運行30個循環;60℃
保溫30分鐘;4℃持續保溫直至取出樣品;
3)電泳、檢測
取0.5μl分子量內標和10μl去離子甲酰胺,乘以樣品數,配成混合液;
以每管10μl混合液,再分別加入1μl擴增產物和等位基因階梯,離心將液體收集到離心
管的底部;
樣品95℃變性4分鐘,然后迅速冰上冷卻4分鐘,使DNA完全變性并保持變性狀態;
將樣品放在基因分析儀中開始電泳檢測;
電泳結束,分析實驗數據得到圖譜和基因分型結果。
3.一種用于權利要求1或2所述的復合擴增方法的如SEQ ID NO:1-34的引物的混合物。
4.一種應用權利要求1或2所述復合擴增方法的17個X染色體短串聯重復序列的復合擴
增試劑盒,所述基因座為Amelogenin、DXS6795、DXS9902、DXS8378、HPRTB、GATA165B12、
DXS7132、DXS7424、DXS6807、DXS6803、GATA172D05、DXS6800、DXS10134、GATA31E08、
DXS10159、DXS6789和DXS6810,該試劑盒包含SEQ ID NO:1-34所示的引物。
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