本發(fā)明公開了一種熒光定量PCR引物探針組和試劑盒及檢測三種芽孢桿菌的方法，包括具有SEQ ID NO.1?6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7?9所示核苷酸序列的探針。本發(fā)明還提供了一種熒光定量PCR檢測三種芽孢桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的熒光定量PCR引物探針組和Hotstar DNA聚合酶。通過上述技術(shù)方案本發(fā)明顯著地提高了對三種芽孢桿菌同時進行檢測的敏感性、特異性和簡便性。

1.多重PCR檢測三種芽孢桿菌用引物探針組，其特征在于，包括由SEQ ID NO.1-6所示
核苷酸序列組成的引物，以及，由SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列組成的探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組，其中，還包括由SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序
列組成的引物，以及，由SEQ ID NO.12所示核苷酸序列組成的探針。
3.一種用于非診斷目的的三重熒光定量PCR檢測三種芽孢桿菌的檢測方法，其特征在
于，所述檢測方法包括如下步驟：
（1）提取待測樣本的總DNA；
（2）以所述總DNA為模板，并使用權(quán)利要求1或2所述的引物探針組，進行三重熒光定量
PCR反應；
（3）收集檢測通道熒光信號，得到檢測結(jié)果；
在空白對照、陽性對照和陽性內(nèi)對照成立的情況下，在每個熒光檢測通道中：
a）若樣本有S型擴增，且C_T值小于35，則判定樣本為陽性；
b）若樣本有S型擴增，且C_T值小于40并大于等于35，則判定為不確定樣本，需重新提取核
酸后進行復檢；若復檢的樣本仍有S型擴增，且C_T值小于40，則判定樣本為陽性，否則為陰
性；
c）若樣本無明顯S型擴增曲線，但報告有C_T值，則判定為非特異性擴增；所述三種芽孢桿
菌為蠟樣芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其中，每條引物的最終使用濃度各自為0.3-0.6μM，
每條探針的最終使用濃度各自為0.1-0.3μM。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其中，三重熒光定量PCR反應的條件包括如下步
驟：
a：95℃ 10min；
b：95℃ 15-60s，
c：50-60℃ 15-60s，b-c循環(huán)10-15個反應；
d：95℃ 15-60s，
e：60-70℃ 15-60s，d-e循環(huán)25-30個反應。
6.三重熒光定量PCR檢測三種芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要
求1或2所述的引物探針組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括5×反應體系緩沖液、Hotstar
DNA聚合酶、10×引物探針混合物、陽性對照和超純水。