本發明屬于基因突變檢測領域，尤其涉及利用Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法和試劑盒。為了克服現有人類EGFR基因突變檢測方法及試劑盒的不足,本發明提供了一種基于Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒，由于在EGFR基因片段擴增體系中引入耐熱DNA連接酶和針對突變位點的特定連接引物體系，極大抑制了樣品中的野生型EGFR基因片段的擴增，可以基于擴增片段條帶直接判定野生型樣本；或使得低突變含量樣品其最終的PCR產物中突變片段的比例高于50%，從而保證了Sanger測序對于雜合基因片段體系的準確識別；本發明方法及試劑盒可以基于Sanger測序檢測出樣本中含量低至1%的EGFR基因突變，準確率極高，檢測費用低廉并且還可能測出新的未知突變。

1.一種基于Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的引物，其特征在于：所述引物由
擴增引物組和連接引物組組成，所述連接引物組的核苷酸序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.ID
NO.26所示，所述引物必須同耐熱DNA酶在同一反應體系下共同使用。
2.一種基于Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒，其特征在于：所述試劑
盒是在EGFR基因片段擴增體系中加入了如權利要求1所述的連接引物組、耐熱DNA連接酶及
其緩沖液。
3.根據權利要求2所述的基于Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒，其特
征在于：所述試劑盒包括DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、8條擴增引物、18條連接引物、耐熱
DNA連接酶和耐熱DNA連接酶緩沖液；所述8條擴增引物其序列如SEQ.ID NO.1- SEQ.ID
NO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4 、SEQ.ID NO.5和
SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8分別用于靶向第18、19、20、21號外顯子片段的擴
增；所述18條連接引物其序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.ID NO.26所示，其中SEQ.ID NO.9和
SEQ.ID NO.10靶向第18號外顯子的3種突變位點，SEQ.ID NO.11和SEQ.ID NO.12靶向第19
號外顯子的19種突變位點，SEQ.ID NO.13-SEQ.ID NO.22靶向第20號外顯子的5種突變位
點，SEQ.ID NO.23-SEQ.ID NO.26靶向第21號外顯子的2種突變位點。
4.根據權利要求3所述的基于Sanger測序靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒，其特
征在于：所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5 U/μL ，具有耐熱性能；所述PCR緩沖液是由
pH=8.3的100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl₂組成；所述dNTPs是由
dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；所述擴增引物的濃度均為10μmol/L ；所
述連接引物的濃度均為10μmol/L ；所述耐熱DNA連接酶的酶活力單位濃度不低于4000 U/μ
L ，在正常體系下95度保溫1h酶活力不低于原酶活的60%；所述耐熱DNA連接酶緩沖液的配
制為20 mM Tris-HCl、25 mM 乙酸鉀、10 mM 乙酸鎂、1 mM NAD、10 mM DTT、0.1% Triton
X-100，pH=7.6。