本發明公開了一種RALGDS和VAV1基因啟動子區特異性位點甲基化水平的試劑盒及其應用，特點是利用一種焦磷酸測序法定量檢測RALGDS基因cg16872071位點和VAV1基因cg13470920、cg26571739位點的甲基化水平，設計了針對每個位點的獨有引物，分別包括上、下游PCR擴增引物和甲基化測序引物，并且其中一條擴增引物帶有生物素標記。本發明在原發性肝細胞癌患者中篩查RALGDS和VAV1基因的特異性位點，采用焦磷酸測序技術對其甲基化水平進行快速準確檢測。

1.一種針對肝癌相關的RALGDS基因啟動子區特異性甲基化位點cg16872071的焦磷酸測序PCR上、下游引物和甲基化測序引物在制備輔助檢測和診斷原發性肝細胞癌的試劑盒中的應用。2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，PCR上游引物序列如SEQ ID NO.1所示：5′-TGGGTAGTGAAAATGATTTTTTTAAATAGT-3′；PCR下游引物序列如SEQ ID NO.2所示：biotin-5′-CTAAACACATAATCAACCTCTCCAAACTC-3′；甲基化測序引物序列如SEQ ID NO.3所示：5′-AGTTGAGGGGAGGATG-3′。3.一種針對肝癌相關的VAVl基因啟動子區特異性甲基化位點cg13470920和cg26571739的焦磷酸測序PCR上、下游引物和甲基化測序引物在制備輔助檢測和診斷原發性肝細胞癌的試劑盒中的應用。4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，針對位點cg13470920時，PCR上游引物序列如SEQ ID NO.4所示：5′-GTTTTGGGTAGGAGGTAGTTATGGAG-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.5所示：biotin-5′-ACACCCCACACTAAATAAACCAATAAATAC-3′；甲基化測序引物序列如SEQ ID NO.6所示：5′-GGTAGTTATGGAGTTGT-3′。5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，針對位點cg26571739時，PCR上游引物序列如SEQ ID NO.7所示：biotin-5′-AGTGGGAGGAAGAAAGAGATGTTAGAT-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.8所示：5′-TACCACTTCCTCTTCTTTACCTATAAC-3′；甲基化測序引物序列如SEQ ID NO.9所示：5′-CCTCTTCTTTACCTATAACT-3′。