本發(fā)明提供了用于分析樣品DNA的甲基化狀況的半甲基化接頭，包含此類半甲基化接頭的試劑盒，此類半甲基化接頭和試劑盒的用途，以及使用此類半甲基化接頭分析樣品DNA的甲基化狀況的方法。

1.一種半甲基化的接頭，所述接頭的正鏈的胞嘧啶(C)全部被甲
基化修飾，而負(fù)鏈的胞嘧啶全部未被甲基化修飾，所述接頭的長(zhǎng)度為
至少20個(gè)堿基，所述接頭的正鏈的5′端序列與其負(fù)鏈的3′端序列不
互補(bǔ)，并且正鏈的3′端序列與負(fù)鏈的5′端序列互補(bǔ)，或者所述接頭的
正鏈的3′端或負(fù)鏈的5′端具有懸突。
2.權(quán)利要求1的半甲基化的接頭，所述接頭的正鏈的3′端具有單
個(gè)堿基的懸突。
3.權(quán)利要求2的半甲基化的接頭，所述單個(gè)堿基為堿基T。
4.包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的半甲基化的接頭的試劑盒。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，所述接頭的正鏈和負(fù)鏈分別以單鏈形式
單獨(dú)存在，或，所述接頭以雙鏈形式存在。
6.權(quán)利要求4的試劑盒，所述試劑盒還包括用于分析樣品DNA
的甲基化狀況的其他試劑。
7.權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述其他試劑是指能夠與經(jīng)重亞硫
酸鹽處理的所述半甲基化接頭的負(fù)鏈退火的引物，能夠與所述接頭的
正鏈的互補(bǔ)鏈退火的引物，針對(duì)重亞硫酸鹽處理后的所述接頭而特別
設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)第一分子實(shí)體修飾的dCTP，或者與第一分子實(shí)體特
異性結(jié)合的第二分子實(shí)體。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，所述第一分子實(shí)體和第二分子實(shí)體是抗
原和抗體或抗原結(jié)合片段，或者配體和受體，或者生物素和親和素。
9.權(quán)利要求7的試劑盒，所述經(jīng)第一分子實(shí)體修飾的dCTP是生
物素修飾的dCTP，并且第二分子實(shí)體是鏈霉親和素磁珠。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述生物素修飾的dCTP是指生
物素-11-dCTP。
11.權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)的試劑盒，所述試劑盒用于分析樣品
DNA的甲基化狀況。
12.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的半甲基化的接頭和／或權(quán)利要求4-11任
一項(xiàng)的試劑盒用于分析樣品DNA的甲基化狀況的非診斷或治療目的
的用途。
13.權(quán)利要求12的用途，所述樣品DNA是文庫(kù)DNA或基因組
DNA。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述基因組DNA是指細(xì)菌，病毒，
植物或動(dòng)物的基因組DNA。
15.權(quán)利要求13的用途，其中所述基因組DNA是指哺乳動(dòng)物的
基因組DNA。
16.權(quán)利要求13的用途，其中所述基因組DNA是人的基因組
DNA。
17.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的半甲基化的接頭用于制備試劑盒的用
途，所述試劑盒用于分析樣品DNA的甲基化狀況。
18.用于分析樣品DNA的甲基化狀況的非診斷或治療目的的方
法，其包括以下步驟：
1)將權(quán)利要求1的半甲基化的接頭連接至待分析的樣品DNA的
兩端，從而得到連接產(chǎn)物；
2)用重亞硫酸鹽處理步驟1)中的連接產(chǎn)物，以將非甲基化的胞嘧
啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶；
3)以重亞硫酸鹽處理后的產(chǎn)物為模板，用能夠與經(jīng)重亞硫酸鹽處
理的半甲基化接頭的負(fù)鏈退火的引物進(jìn)行第一次互補(bǔ)鏈合成，從而得
到第一次互補(bǔ)鏈合成產(chǎn)物；
4)用尿嘧啶糖基化酶處理步驟3)中的第一次互補(bǔ)鏈合成產(chǎn)物，以
除去含有尿嘧啶的DNA鏈；
5)以尿嘧啶糖基化酶處理后的產(chǎn)物為模板，加入dTTP、dATP、
dGTP以及經(jīng)第一分子實(shí)體修飾的dCTP，并使用能夠與半甲基化接
頭的正鏈的互補(bǔ)鏈退火的引物，進(jìn)行第二次互補(bǔ)鏈合成，從而得到第
二次互補(bǔ)鏈合成產(chǎn)物；
6)使用能夠與第一分子實(shí)體特異性結(jié)合的第二分子實(shí)體，富集并
分離摻入了經(jīng)第一分子實(shí)體修飾的dCTP的第二次互補(bǔ)鏈合成產(chǎn)物，
從而得到分離產(chǎn)物；
7)對(duì)步驟6)中的分離產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，其中，除了所使用的接
頭序列外，分離產(chǎn)物中的胞嘧啶即為所述樣品DNA中被甲基化的胞
嘧啶。
19.權(quán)利要求18的方法，所述樣品DNA是文庫(kù)DNA或基因組
DNA。
20.權(quán)利要求19的方法，所述基因組DNA是指細(xì)菌，病毒，植
物或動(dòng)物的基因組DNA。
21.權(quán)利要求19的方法，所述基因組DNA是指哺乳動(dòng)物的基因
組DNA。
22.權(quán)利要求19的方法，所述基因組DNA是人的基因組DNA。
23.權(quán)利要求18的方法，在步驟1)之前，對(duì)所述樣品DNA進(jìn)行
片段化。
24.權(quán)利要求23的方法，通過霧化法、超聲片段化法、HydroShear
法或酶切處理法將所述樣品DNA片段化。
25.權(quán)利要求23的方法，通過超聲片段化法將所述樣品DNA片
段化。
26.權(quán)利要求18的方法，通過平端連接法，TA連接法，粘性末
端連接法將所述接頭連接到所述樣品DNA的兩端。
27.權(quán)利要求18的方法，通過TA連接法將所述接頭連接到所述
樣品DNA的兩端。
28.權(quán)利要求18的方法，所述第一分子實(shí)體和第二分子實(shí)體是抗
原和抗體或抗原結(jié)合片段，或者配體和受體，或者生物素和親和素。
29.權(quán)利要求18的方法，所述第一分子實(shí)體是生物素，并且第二
分子實(shí)體是鏈霉親和素；
30.權(quán)利要求18的方法，所述經(jīng)第一分子實(shí)體修飾的dCTP是生
物素修飾的dCTP，并且第二分子實(shí)體是鏈霉親和素磁珠。
31.權(quán)利要求30的方法，所述生物素修飾的dCTP是指生物素
-11-dCTP。
32.權(quán)利要求18的方法，在對(duì)步驟6)中的分離產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分
析之前，使用針對(duì)重亞硫酸鹽處理后的半甲基化接頭而特別設(shè)計(jì)的引
物對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
33.權(quán)利要求18的方法，對(duì)步驟6)中的分離產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)
序分析。
34.權(quán)利要求33的方法，使用SOLEXA、SOLID和Roche454
測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。
35.權(quán)利要求18的方法，在任意兩個(gè)相鄰步驟之間，進(jìn)行產(chǎn)物的
回收和純化。
36.權(quán)利要求18的方法，在所有步驟之間進(jìn)行產(chǎn)物的回收與純化。