1.一種檢測n種靶核酸序列在樣品中的存在的方法，其中，n為≥2的整數，并且，所述方
法包括以下步驟：
(1)針對待檢測的每一種靶核酸序列，提供一種上游寡核苷酸序列和一種媒介子探針；
其中，所述上游寡核苷酸序列包含與所述靶核酸序列互補的序列；并且，所述媒介子探針從
5'至3'方向包含媒介子序列和靶特異性序列，所述媒介子序列包含不與所述靶核酸序列互
補的序列，并且，所述靶特異性序列包含與所述靶核酸序列互補的序列；并且，當與所述靶
核酸序列雜交時，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特異性序列的上游；并且，所有媒介子
探針所包含的媒介子序列彼此不同；
并且，在允許核酸雜交的條件下，將所述樣品與所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子
探針接觸；
(2)在允許切割媒介子探針的條件下，將步驟(1)的產物與具有5'核酸酶活性的酶接
觸；
(3)提供m種檢測探針，并且在允許核酸雜交的條件下，將步驟(2)的產物與所述m種檢
測探針接觸，其中，
m為小于n且大于0的整數，并且
每一種檢測探針各自獨立地從3'至5'方向包含，與一種或多種媒介子序列或其部分互
補的一種或多種捕獲序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m種檢測探針
包含至少n種捕獲序列，其分別與步驟(1)中提供的n種媒介子探針的媒介子序列或其部分
互補；并且，
每一種檢測探針各自獨立地標記有報告基團和淬滅基團，其中，所述報告基團能夠發
出信號，并且，所述淬滅基團能夠吸收或淬滅所述報告基團發出的信號；并且，每一種檢測
探針在與其互補序列雜交的情況下發出的信號不同于在未與其互補序列雜交的情況下發
出的信號；并且，
(4)在允許核酸聚合酶進行延伸反應的條件下，將步驟(3)的產物與核酸聚合酶接觸；
(5)對步驟(4)的產物進行熔解曲線分析；并根據熔解曲線分析的結果，確定所述n種靶
核酸序列是否存在于所述樣品中。
2.權利要求1的方法，其中，n為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、25、30、35、40或更大的整數。
3.權利要求1的方法，其中，m小于n且為≥2的整數。
4.權利要求3的方法，其中，所述m種檢測探針各自標記有不同的報告基團。
5.權利要求3的方法，其中，m為≥5的整數。
6.權利要求3的方法，其中，m為≥8的整數。
7.權利要求3的方法，其中，m為≥10的整數。
8.權利要求1的方法，其中，m為1、2、3、4、5或6。
9.權利要求1的方法，其中，步驟(1)提供了2種、3種、4種、5種、6種、8種、10種、15種、20
種、25種、30種、35種、40種、45種或更多種媒介子探針；并且，步驟(3)提供了1種、2種、3種、4
種、5種、6種、8種、10種或更多種檢測探針。
10.權利要求1的方法，其中，所述m種檢測探針包含相同的報告基團；并且，在步驟(5)
中，對步驟(4)的產物進行熔解曲線分析，并根據所獲得的熔解曲線中的熔解峰(熔點)來確
定某一種靶核酸序列的存在。
11.權利要求1的方法，其中，所述m種檢測探針所包含的報告基團彼此不同；并且，在步
驟(5)中，在對步驟(4)的產物進行熔解曲線分析時，分別實時監測每一種報告基團的信號，
由此獲得各自與一種報告基團的信號對應的多條熔解曲線；隨后，根據報告基團的信號種
類以及熔解曲線中的熔解峰(熔點)來確定某一種靶核酸序列的存在。
12.權利要求1的方法，其中，m＝1，并且n為≥2的整數。
13.權利要求12的方法，其中，n為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20或更大的整數。
14.權利要求12的方法，其中，所述方法包括下述步驟：
(1)針對待檢測的每一種靶核酸序列，提供一種上游寡核苷酸序列和一種媒介子探針；
其中，所述上游寡核苷酸序列包含與所述靶核酸序列互補的序列；并且，所述媒介子探針從
5'至3'方向包含媒介子序列和靶特異性序列，所述媒介子序列包含不與所述靶核酸序列互
補的序列，并且，所述靶特異性序列包含與所述靶核酸序列互補的序列；并且，當與所述靶
核酸序列雜交時，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特異性序列的上游；并且，所有媒介子
探針所包含的媒介子序列彼此不同；
并且，在允許核酸雜交的條件下，將所述樣品與所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子
探針接觸；
(2)在允許切割媒介子探針的條件下，將步驟(1)的產物與具有5'核酸酶活性的酶接
觸；
(3)在允許核酸雜交的條件下，將步驟(2)的產物與一種檢測探針接觸，所述檢測探針
從3'至5'方向包含，與每一種媒介子序列或其部分互補的捕獲序列，以及模板序列
(templating sequence)；并且，所述檢測探針標記有報告基團和淬滅基團，其中，所述報告
基團能夠發出信號，并且，所述淬滅基團能夠吸收或淬滅所述報告基團發出的信號；并且，
所述檢測探針在與其互補序列雜交的情況下發出的信號不同于在未與其互補序列雜交的
情況下發出的信號；
(4)在允許核酸聚合酶進行延伸反應的條件下，將步驟(3)的產物與核酸聚合酶接觸；
(5)對步驟(4)的產物進行熔解曲線分析；并根據熔解曲線分析的結果，確定所述n種靶
核酸序列是否存在于所述樣品中。
15.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述樣品包含或是DNA，或RNA，或核酸的混合
物。
16.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述靶核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶核
酸序列是單鏈的或雙鏈的。
17.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述樣品或靶核酸序列獲自選自下列的來源：
原核生物，真核生物，病毒或類病毒。
18.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述媒介子探針具有選自下列的一個或多個特
征：
(1)所述媒介子探針包含或者由天然存在的核苷酸，經修飾的核苷酸，非天然的核苷
酸，或其任何組合組成；
(2)所述媒介子探針的長度為15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，
70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或140-150nt；
(3)所述媒介子探針中的靶特異性序列的長度為10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，
50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，或130-
140nt；
(4)所述媒介子探針中的媒介子序列的長度為5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-
50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，
或130-140nt；和
(5)所述媒介子探針具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封閉的。
19.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述上游寡核苷酸序列具有選自下列的一個或
多個特征：
(1)所述上游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，經修飾的核苷酸，非天然的
核苷酸，或其任何組合組成；
(2)所述上游寡核苷酸序列的長度為15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，
60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或
140-150nt；
(3)所述上游寡核苷酸序列在與靶核酸序列雜交后，位于媒介子探針的上游遠端，或位
于媒介子探針的上游鄰近，或與媒介子探針的靶特異性序列具有部分重疊的序列；和
(4)所述上游寡核苷酸序列為特異于靶核酸序列的引物或者特異于靶核酸序列的探
針。
20.權利要求1-14任一項的方法，其中，在步驟(2)中，所述具有5'核酸酶活性的酶切割
與靶核酸序列雜交的媒介子探針，并釋放出包含完整媒介子序列或者媒介子序列的一部分
(5'-末端部分)的媒介子片段。
21.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述具有5'核酸酶活性的酶為具有5'核酸酶活
性的核酸聚合酶。
22.權利要求21的方法，其中，所述核酸聚合酶具有5'外切核酸酶活性。
23.權利要求21的方法，其中，所述核酸聚合酶為DNA聚合酶。
24.權利要求21的方法，其中，所述核酸聚合酶為熱穩定的DNA聚合酶。
25.權利要求23的方法，其中，所述DNA聚合酶獲自選自下列的細菌：Thermus
aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,
Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus
chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus
oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,
Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho
africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus
gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,
Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium
occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。
26.權利要求23的方法，其中，所述DNA聚合酶為Taq聚合酶。
27.權利要求21的方法，其中，在步驟(2)中，所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶催化
上游寡核苷酸序列的延伸，并誘導媒介子探針的切割。
28.權利要求1-14任一項的方法，其中，在步驟(2)中，使用核酸聚合酶以靶核酸序列為
模板催化上游寡核苷酸序列的延伸，并且隨后，所述具有5'核酸酶活性的酶結合至上游寡
核苷酸序列的延伸產物，并催化媒介子探針的切割。
29.權利要求1-14任一項的方法，其中，在步驟(1)中，除了所述上游寡核苷酸序列和媒
介子探針之外，針對待檢測的每一種靶核酸序列，還提供一種下游寡核苷酸序列；其中，所
述下游寡核苷酸序列包含與所述靶核酸序列互補的序列；并且，當與所述靶核酸序列雜交
時，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特異性序列的下游；然后，在允許核酸雜交的條件
下，將所述樣品與所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探針和下游寡核苷酸序列接觸。
30.權利要求29的方法，其中，在步驟(2)中，在允許核酸擴增的條件下，將步驟(1)的產
物與具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接觸。
31.權利要求29的方法，其中，所述下游寡核苷酸序列具有選自下列的一個或多個特
征：
(1)所述下游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，經修飾的核苷酸，非天然的
核苷酸，或其任何組合組成；和
(2)所述下游寡核苷酸序列的長度為15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，
60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，或
140-150nt。
32.權利要求29的方法，其中，步驟(1)中提供的所有上游寡核苷酸序列和下游寡核苷
酸序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列。
33.權利要求32的方法，其中，在步驟(1)中，除了所述上游寡核苷酸序列、媒介子探針
和下游寡核苷酸序列之外，還提供一種通用引物，所述通用引物具有與所述相同的寡核苷
酸序列互補的序列；然后，在允許核酸雜交的條件下，將所述樣品與所提供的上游寡核苷酸
序列、媒介子探針、下游寡核苷酸序列和通用引物接觸。
34.權利要求33的方法，其中，所述通用引物具有選自下列的一個或多個特征：
(1)所述通用引物包含或者由天然存在的核苷酸，經修飾的核苷酸，非天然的核苷酸，
或其任何組合組成；和
(2)所述通用引物的長度為8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
35.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述檢測探針包含多種捕獲序列；并且，所述多
種捕獲序列以相鄰的方式、以間隔有連接序列的方式，或者以重疊的方式排列。
36.權利要求1-14任一項的方法，其中，所述檢測探針具有選自下列的一個或多個特
征：
(1)所述檢測探針包含或者由天然存在的核苷酸，經修飾的核苷酸，非天然的核苷酸，
或其任何組合組成；
(2)所述檢測探針的長度為15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，
70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，
600-700nt，700-800nt，800-900nt，或900-1000nt；
(3)所述檢測探針中的捕獲序列的長度為10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-
60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-
300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，或450-500nt；
(4)所述檢測探針中的模板序列的長度為1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，
40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-
400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，或800-900nt；
(5)所述檢測探針具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封閉的；
(6)所述檢測探針為自淬滅探針；
(7)所述檢測探針中的報告基團為熒光基團；并且，淬滅基團為能夠吸收/淬滅所述熒
光的分子或基團；
(8)所述檢測探針具有抵抗核酸酶活性的抗性；
(9)所述檢測探針是線性的，或者具有發夾結構。
37.權利要求36的方法，其中，所述檢測探針為自淬滅探針；并且，所述檢測探針在其5'
末端或上游標記有報告基團且在其3'末端或下游標記有淬滅基團，或者在其3'末端或下游
標記報告基團且在5'末端或上游標記淬滅基團。
38.權利要求37的方法，其中，所述報告基團和淬滅基團相距10-80nt或更長的距離。
39.權利要求36的方法，其中，所述熒光基團選自ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL
![]()
Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor
Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,和Quasar 705。
40.權利要求36的方法，其中，所述淬滅基團選自DABCYL、BHQ、ECLIPSE、和/或TAMRA。
41.權利要求40的方法，其中，所述BHQ選自BHQ-1或者BHQ-2。
42.權利要求36的方法，其中，所述檢測探針具有抵抗5'核酸酶活性的抗性。
43.權利要求36的方法，其中，所述檢測探針的主鏈包含抵抗核酸酶活性的修飾。
44.權利要求36的方法，其中，所述檢測探針的主鏈包含選自下列的修飾：硫代磷酸酯
鍵，烷基磷酸三酯鍵，芳基磷酸三酯鍵，烷基膦酸酯鍵，芳基膦酸酯鍵，氫化磷酸酯鍵，烷基
氨基磷酸酯鍵，芳基氨基磷酸酯鍵，2'-O-氨基丙基修飾，2'-O-烷基修飾，2'-O-烯丙基修
飾，2'-O-丁基修飾，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修飾。
45.權利要求1-14任一項的方法，其中，在步驟(4)中，在允許核酸聚合酶進行延伸反應
的條件下，所述核酸聚合酶以檢測探針為模板，對雜交至檢測探針的媒介子片段進行延伸，
并由此形成雙鏈體。
46.權利要求45的方法，其中，步驟(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶為具有5'核
酸酶活性的核酸聚合酶，并且與步驟(4)中所使用的核酸聚合酶相同。
47.權利要求1-14任一項的方法，其中，步驟(1)-(4)通過包含下述步驟(a)-(e)的方案
來進行：
(a)提供m種檢測探針，并且針對待檢測的每一種靶核酸序列，提供一種上游寡核苷酸
序列、一種媒介子探針和一種下游寡核苷酸序列；其中，所述下游寡核苷酸序列如權利要求
29或31所定義；
(b)將待檢測的樣品與所提供的檢測探針，上游寡核苷酸序列，媒介子探針和下游寡核
苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶混合；
(c)在允許核酸變性的條件下，溫育前一步驟的產物；
(d)在允許核酸退火或雜交的條件下，溫育前一步驟的產物；和
(e)在允許核酸延伸的條件下，溫育前一步驟的產物。
48.權利要求47的方法，其中，所述具有5'核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶為DNA
聚合酶。
49.權利要求47的方法，其中，所述具有5'核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶為熱穩
定的DNA聚合酶。
50.權利要求47的方法，其中，在步驟(a)中，還提供一種通用引物，所述通用引物如權
利要求33或34所定義；并且，在步驟(b)中，將待檢測的樣品與所提供的檢測探針，上游寡核
苷酸序列，媒介子探針，下游寡核苷酸序列，具有5'核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶，
以及通用引物混合。
51.權利要求47的方法，其中，所述方法還包括步驟(f)：重復步驟(c)-(e)一次或多次。
52.權利要求1-14任一項的方法，其中，在步驟(5)中，對步驟(4)的產物進行逐漸的升
溫或降溫并實時監測每一種檢測探針上的報告基團發出的信號，從而獲得每一種報告基團
的信號強度隨著溫度變化而變化的曲線。
53.權利要求52的方法，其中，對所獲得的曲線進行求導，從而獲得步驟(4)的產物的熔
解曲線。
54.權利要求53的方法，其中，根據熔解曲線中的熔解峰(熔點)，確定對應于所述熔解
峰(熔點)的媒介子片段的存在；隨后，通過媒介子片段中的媒介子序列與靶核酸序列的對
應關系，確定與所述媒介子片段對應的靶核酸序列的存在。
55.一種探針組(probe set)，其包含一種檢測探針，以及至少兩種的媒介子探針，其
中，
所述媒介子探針各自獨立地從5'至3'方向包含媒介子序列和靶特異性序列，所述靶特
異性序列包含與一種靶核酸序列互補的序列，所述媒介子序列包含不與所述靶核酸序列互
補的序列，并且，所有媒介子探針所包含的媒介子序列彼此不同；和
所述檢測探針從3'至5'方向包含，與每一種媒介子序列或其部分互補的捕獲序列，以
及模板序列(templating sequence)；并且，所述檢測探針標記有報告基團和淬滅基團，其
中，所述報告基團能夠發出信號，并且，所述淬滅基團能夠吸收或淬滅所述報告基團發出的
信號；并且，所述檢測探針在與其互補序列雜交的情況下發出的信號不同于在未與其互補
序列雜交的情況下發出的信號。
56.權利要求55的探針組，其中，所述探針組包含2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、
10種、12種、15種、20種或更多種媒介子探針。
57.權利要求55-56任一項的探針組，其中，所有媒介子探針所包含的媒介子序列彼此
不同；并且，所有媒介子探針所包含的靶特異性序列彼此不同。
58.權利要求55-56任一項的探針組，其中，所有媒介子探針各自靶向不同的靶核酸序
列。
59.權利要求55-56任一項的探針組，其中，所述媒介子探針如權利要求18所定義；和/
或，所述檢測探針如權利要求35-44任一項所定義。
60.一種試劑盒，其包含一種或多種如權利要求55-59任一項所定義的探針組。
61.權利要求60的試劑盒，其中，所述試劑盒包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、
9種、10種或更多種探針組。
62.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒中的所有媒介子序列各自靶向
不同的靶核酸序列。
63.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒中的所有媒介子探針所包含的
媒介子序列彼此不同。
64.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒中的所有媒介子探針所包含的
靶特異性序列彼此不同。
65.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒中的所有檢測探針各自獨立地
標記有相同或不同的報告基團。
66.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒還包含：上游寡核苷酸序列、下
游寡核苷酸序列、通用引物、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何組合。
67.權利要求66的試劑盒，其中，所述上游寡核苷酸序列為權利要求1或19中所定義的
上游寡核苷酸序列。
68.權利要求66的試劑盒，其中，所述下游寡核苷酸序列為權利要求29或31中所定義的
下游寡核苷酸序列。
69.權利要求66的試劑盒，其中，所述通用引物為權利要求33或34中所定義的通用引
物。
70.權利要求60-61任一項的試劑盒，其中，所述試劑盒還包含：用于進行核酸雜交的試
劑、用于進行媒介子探針切割的試劑、用于進行核酸延伸的試劑、用于進行核酸擴增的試
劑、或其任何組合。
