本發(fā)明提供可以選擇性地同源重組目標(biāo)基因的方法、以及利用該方法得到的重組DNA分子。同源重組方法，該方法使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR產(chǎn)物包含兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線性化載體具有包含與該PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，在VP1的末端側(cè)具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2(T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，該方法包括：使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上述載體中，由此得到在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子。克隆方法，該方法利用上述同源重組方法，制備在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，之后擴(kuò)增所得的重組DNA分子。

1.同源重組方法，該方法使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR
產(chǎn)物包含兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線
性化載體具有包含與該PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的
核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，并且，在VP1的末端側(cè)具有
包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、
和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷
酸序列的同源重組區(qū)VT2，其中T1和T2的至少一方具有靶基因所特
有的核苷酸序列，
該方法包括：使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上
述載體中，由此得到在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組
DNA分子。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中T1和T2的兩方具有靶基因所
特有的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2的一
方或兩方具有靶基因所特有的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中PCR產(chǎn)物是通過2次PCR而制
備的產(chǎn)物，在第1次PCR中，使用包含T1序列的擴(kuò)增用引物和包含
P3序列的擴(kuò)增用引物來實施，其中P3序列與上述載體所具有的同源
重組區(qū)VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性；在第2次PCR中，
使用包含P1序列的擴(kuò)增用引物和包含P2序列的擴(kuò)增用引物來實施。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中包含P1序列的擴(kuò)增用引物的3’
端側(cè)區(qū)和包含T1序列的擴(kuò)增用引物的5’端側(cè)區(qū)具有部分重復(fù)的序列，
而包含P2序列的擴(kuò)增用引物和包含P3序列的擴(kuò)增用引物具有或不具
有部分重復(fù)的序列。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2分別
為10個核苷酸以上。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和
VP2+VT2分別為11個核苷酸以上。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2的一
方或兩方來自核酸酶耐性寡引物。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中上述靶基因為抗體基因或T細(xì)
胞受體基因，該靶基因包含來自上述抗體基因或T細(xì)胞受體基因的恒
定區(qū)的序列和來自可變區(qū)的序列，上述載體的同源重組區(qū)VP1+VT1
和VP2+VT2的一方為來自抗體基因或T細(xì)胞受體基因的恒定區(qū)的序
列。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中上述載體的同源重組區(qū)
VP1+VT1和VP2+VT2的另一方不具有來自抗體基因和T細(xì)胞受體基
因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求1～10中任一項所述的方法，其中上述同源重組反
應(yīng)是使用Red即Redα/β或RecE/T體系在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1～10中任一項所述的方法，其中上述同源重組反
應(yīng)通過In-Fusion法來進(jìn)行。
13.靶基因的克隆方法，該方法包括：利用權(quán)利要求1～12中任
一項所述的同源重組方法，制備在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)
物的重組DNA分子，之后擴(kuò)增具有所得重組DNA分子的重組體。
14.試劑盒，其中含有線性化載體，該線性化載體用于同源重組
方法，所述同源重組方法包括：得到在載體中特異性地插入有PCR產(chǎn)
物的重組DNA分子，所述PCR產(chǎn)物含有在兩末端具有擴(kuò)增用引物序
列P1和P2的靶基因序列，
上述線性化載體具有包含與PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2
同源的核苷酸序列的同源區(qū)VP1和VP2，并且，在VP1的末端側(cè)具
有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)
VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源
的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2。