來源于嗅粘膜神經元細胞分離制備技術本發明提供了一種嗅粘膜神經元的分離培養、傳代、凍存、分化技術。特色步驟包括：1、嗅粘膜神經元基礎培養基的配置；2、原代培養技術；3、專用傳代培養基的配置：收集處理培養基上清液，用于配置嗅粘膜神經元傳代培養基；4、重復傳代培養技術；5、凍存保護液的配置；收集處理培養基上清液，用于配置嗅粘膜神經元細胞凍存液；6、超低溫冷凍保存；7、細胞復蘇分化技術。本專利選取上鼻甲三分之一嗅區粘膜進行分離培養增殖、凍存、分化，并獲得大量高純度的嗅粘膜神經元細胞，目前大量基礎和臨床實驗結果證明，該細胞具有綜合神經修復作用，能有效改善神經系統疾病和損害患者的神經損傷功能和生存質量。

1.一種來源于嗅粘膜的神經元細胞的制備方法，其特征在于以下操作步驟：(1)嗅粘膜嗅神經元基礎培養基的配制：用DMEM/DF12、IL-2、胰島素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA神經營養生長因子配制嗅粘膜嗅神經元基礎培養基；(2)培養瓶包被：用多聚賴氨酸包被培養瓶；(3)原代培養：將獲自上鼻甲三分之一嗅區粘膜的嗅粘膜組織塊加入基礎培養基混勻，轉移至事先用多聚賴氨酸包被的培養瓶中使其貼壁，在避光37℃，5％CO2培養箱中培養，獲取單細胞；(4)專用傳代培養基的配制：收集要傳代細胞培養基的上清液，加入嗅粘膜嗅神經元基礎培養基并以上清液∶基礎培養基＝0.5∶1的比例進行混合，制成專用傳代培養基；(5)重復傳代培養：按照1∶3的比例將步驟(3)原代培養獲取的單細胞加入步驟(4)配制的傳代培養基，制成細胞懸液，然后轉移至事先用多聚賴氨酸包被過的培養瓶中，在避光37℃，5％CO2培養箱中培養，重復傳代；(6)凍存保護液的配制：收集要凍存細胞的培養基上清液，將人血白蛋白、細胞培養上清液、DMEM/F12、DMSO混合配制獲得細胞專用凍存液；(7)超低溫冷凍保存：收集細胞，按照比例加入步驟(6)配制的凍存保護液，按常規程序冷凍保存；(8)復蘇分化培養：常規復蘇凍存細胞后，用配制的神經元分化培養液培養。2.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)嗅粘膜嗅神經元基礎培養基的配制：A.用DMEM/DF12、IL-2、胰島素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA按比例配制成基礎培養基，B.超級潔凈工作臺內過濾除菌，C.無菌密封分裝，4℃儲存備用。3.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)原代培養：在培養箱中放置30min后，加入基礎培養基。4.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)專用傳代培養基的配制：A.收集每次要傳代細胞的培養基上清液，加入嗅粘膜嗅神經元基礎培養基配成專用傳代培養基并以上清液∶基礎培養基＝0.5∶1的比例進行混合，B.用0.22μm濾器過濾傳代培養基，用于本次傳代細胞培養基。5.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(5)重復傳代培養：A.當細胞生長約90％左右時，用常規方法收集細胞，B.按照收集的細胞∶專用傳代培養基＝1∶3的比例將收集的細胞加入專用傳代培養基，制成細胞懸液，然后轉移至事先包被過的培養瓶中，在避光37℃，5％CO2培養箱中培養，進行重復傳代，C.培養2天后，二分之一換液補加基礎培養基。6.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(6)凍存保護液的配制：A.收集要冷凍細胞的培養基上清液，B.以人血白蛋白∶細胞培養上清液∶DMEM/F12∶DMSO＝5∶2∶2∶1的比例混合配制凍存液，C.用0.22μm濾器過濾凍存液，用于本次細胞凍存的保護液。7.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(7)超低溫冷凍保存：收集細胞，按照比例加入凍存保護液，按常規程序冷凍保存。8.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(8)復蘇分化培養：常規復蘇凍存細胞后，用配制的神經元分化培養液培養。