為了在pH受控的分批發(fā)酵中在礦物鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸，構(gòu)建了經(jīng)遺傳改造的微生物，但不添加質(zhì)粒或外源基因。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸的方法，包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾的微生物。

1.經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株包含對(duì)下述靶基因的遺傳修飾，所述靶
基因編碼：a)乙酸激酶ackA，b)乳酸脫氫酶的ldhA，c)醇脫氫酶adhE，d)丙酮酸-甲酸裂解酶
pflB，e)甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白focA，f)甲基乙二醛合酶mgsA，所述遺傳修飾使所述靶基因編碼的多
肽的酶活性失活，并且所述大腸桿菌菌株過(guò)表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶pck，其中所述大腸
桿菌菌株產(chǎn)生至少200mM琥珀酸。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株還包含對(duì)編碼丙
酮酸氧化酶的靶基因的遺傳修飾，并且所述遺傳修飾使所述基因編碼的多肽的酶活性失
活。
3.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株還包含對(duì)下述靶
基因的遺傳修飾，所述靶基因編碼a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶和c)α-酮丁酸甲酸裂解酶，
并且所述遺傳修飾使所述靶基因的多肽的酶活性失活。
4.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株還包含對(duì)下述靶
基因的遺傳修飾：所述靶基因編碼a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶，c)α-酮丁酸甲酸裂解酶和
d)檸檬酸裂解酶，并且所述遺傳修飾使所述靶基因的多肽的酶活性失活。
5.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株還包含對(duì)下述靶
基因的遺傳修飾：所述靶基因編碼a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶，c)α-酮丁酸甲酸裂解酶，
d)檸檬酸裂解酶和e)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和f)蘋(píng)果酸酶，并且所述遺傳修飾使所述靶基因的多
肽的酶活性失活。
6.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株還包含對(duì)下述靶
基因的遺傳修飾：所述靶基因編碼a)丙酮酸氧化酶，b)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，c)蘋(píng)果酸酶，d)丙
酸激酶，e)α-酮丁酸甲酸裂解酶，f)檸檬酸裂解酶和g)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，并且所述遺傳修飾
使所述靶基因的多肽的酶活性失活。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中通過(guò)缺失、移碼突變、點(diǎn)
突變、插入終止密碼子或其組合使所述基因或其部分、或靶基因或其部分失活。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述經(jīng)遺傳修飾的大腸
桿菌菌株不具有外源基因或其片段或僅具有天然基因。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，條件是：1)所述經(jīng)遺傳修飾的
大腸桿菌菌株中一個(gè)或多個(gè)以下的酶未被失活：a)延胡索酸還原酶；b)ATP合酶；c)2-酮戊
二酸脫氫酶；d)琥珀酸脫氫酶；e)異檸檬酸裂合酶阻抑物；和/或2)所述經(jīng)遺傳修飾的菌株
不含有編碼和/或過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶和/或檸檬
酸合酶的質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述質(zhì)粒是多拷貝質(zhì)粒。
11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述遺傳修飾的大腸桿
菌菌株是經(jīng)代謝演化的。
12.生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或者多種權(quán)利要求1-6中任一
項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，所述培養(yǎng)基包含2％至20％w/v的碳水化合物，所述碳水
化合物是葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纖維二糖、半纖維素
或其組合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中琥珀酸的產(chǎn)率大于或等于90％。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述培養(yǎng)基包含甘油作為底物用于生產(chǎn)琥珀酸。
15.權(quán)利要求2的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，所述菌株還包含對(duì)下述基因的遺傳修
飾，所述基因編碼丙酸激酶和α-酮丁酸甲酸裂解酶，所述遺傳修飾失活由所述基因產(chǎn)生的
多肽的酶活性，其中所述菌株的相關(guān)特征是ΔmgsA,ΔpoxB,ΔackA::翻譯終止序列,Δ
adhE,ΔldhA,Δ(focA-pflB),ΔtdcDE。
16.權(quán)利要求15的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株還包含對(duì)編碼檸檬酸裂
解酶的基因的遺傳修飾，所述遺傳修飾使所述基因編碼的多肽的酶活性失活。
17.權(quán)利要求16的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株還包含編碼蘋(píng)果酸酶的
基因的遺傳修飾，所述遺傳修飾使所述基因產(chǎn)生的多肽的酶活性失活。
18.權(quán)利要求16的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株還包含編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)
氨酶的基因的遺傳修飾，所述遺傳修飾使所述基因產(chǎn)生的多肽的酶活性失活。
19.權(quán)利要求18的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株還包含編碼蘋(píng)果酸酶的
基因的遺傳修飾，所述遺傳修飾使所述基因產(chǎn)生的多肽的酶活性失活。
20.權(quán)利要求19的經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株，其中所述菌株還包含編碼磷酸乙酰轉(zhuǎn)
移酶的基因的遺傳修飾，所述遺傳修飾使所述基因產(chǎn)生的多肽的酶活性失活。