本發(fā)明公開了一種以葡萄糖氧化酶功能化的金納米粒子為探針的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器構(gòu)建方法及其在蛋白質(zhì)激酶活性檢測和抑制劑篩選中的應(yīng)用，屬于電致化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域。將生物素標(biāo)記的DNA和GOx共軛修飾到Au NPs表面制備多功能納米探針GOx/Au NPs/DNA；在蛋白質(zhì)激酶A和三磷酸腺苷的作用下，修飾于電極表面的多肽發(fā)生磷酸化，通過抗原-抗體的特異性識別作用，將生物素標(biāo)記的抗磷酸化絲氨酸抗體結(jié)合到多肽的磷酸化位點上；再利用親和素對生物素反應(yīng)的介導(dǎo)作用，將GOx/Au NPs/DNA捕獲到電極表面。蛋白質(zhì)激酶A的濃度越大，多肽修飾電極表面產(chǎn)生的磷酸化位點越多，組裝于傳感界面的GOx就越多，GOx催化葡萄糖產(chǎn)生的HO越多，魯米諾的發(fā)光越強，實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)激酶A的高靈敏檢測。

1.多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA的制備方法，其特征在于所述制備方法包括以下步驟：（1）Au?NPs的制備：將50?mL濃度為0.05?g/L的氯金酸加入到100?mL的圓底燒瓶中，加熱至沸騰后，在機械攪拌下迅速加入5?mL質(zhì)量百分濃度為1%的檸檬酸鈉溶液并持續(xù)沸騰10?min，當(dāng)溶液顏色由黃色變成深酒紅色時，即獲得平均粒徑為14?nm的穩(wěn)定且單分散的Au?NPs，于4?°C保存?zhèn)溆茫唬?）GOx/Au?NPs/DNA多功能納米探針的制備：先將0.3?mL生物素標(biāo)記的DNA溶液加入到5?mL步驟（1）制備的Au?NPs溶液中，孵化24?h，將DNA修飾的Au?NPs分散于0.1?M?NaCl溶液中；將0.2?mL濃度為2?mg/mL的GOx加入到0.2?mL上述溶液中，25?°C攪拌1?h，再加入1?mL質(zhì)量百分濃度為1%的牛血清白蛋白溶液以封閉Au?NPs表面多余的活性位點；將得到的溶液于13000?rpm離心10?min，除去上層清液后得到多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA，將其重懸于磷酸鹽緩沖溶液中備用；（3）ECL傳感器的組裝：金電極在修飾之前，先分別在粒徑為1.0、0.3和0.05?μm的α-Al₂O₃糊中拋光，再用乙醇和水超聲清洗1?min，在0.5?M的H₂SO₄中于-0.2~1.55?V電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描，直到得到重復(fù)性良好的循環(huán)伏安曲線為止；將清洗好的金電極浸入100?μM半胱氨酸終端的多肽溶液中反應(yīng)16?h，用空白磷酸鹽緩沖溶液清洗后，將多肽修飾電極插入5?mM巰基己醇溶液中，室溫下反應(yīng)1?h以封閉金電極表面的非特異性吸附位點；再將電極插入含有蛋白質(zhì)激酶A和三磷酸腺苷的檢測緩沖溶液中，室溫下反應(yīng)1?h，此時，蛋白質(zhì)激酶A將三磷酸腺苷上的磷酸根轉(zhuǎn)移到多肽鏈上氨基酸殘基的-OH位點上，從而獲得磷酸化多肽修飾電極；隨后將磷酸化多肽修飾電極插入生物素化的抗磷酸化絲氨酸抗體中室溫下孵化1?h，再插入200?μL濃度為0.1?mg/mL的親和素溶液中，室溫下反應(yīng)30?min；最后將電極插入200?μL的GOx/Au?NPs/DNA溶液中，室溫下孵化30?min，即制得ECL生物傳感器。2.如權(quán)利要求1所述的多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA的制備方法，其特征在于步驟（2）中，所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為10?mM，pH為7.4，其中包含0.1?M?NaCl。3.如權(quán)利要求1所述的多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA的制備方法，其特征在于步驟（3）中，所述的檢測緩沖溶液為20?mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH為7.4，其中包含20?mM的MgCl₂。4.如權(quán)利要求1、2或3所述制備方法所制備的多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA在蛋白質(zhì)激酶A活性檢測中的應(yīng)用，其特征在于，隨著蛋白質(zhì)激酶A濃度的增加，魯米諾的電致化學(xué)發(fā)光信號逐漸增大，蛋白質(zhì)激酶A在0.02-40?U/mL范圍內(nèi)與電致化學(xué)發(fā)光信號呈線性，檢測限為0.013?U/mL，表明基于多功能納米探針GOx/Au?NPs/DNA構(gòu)建的生物傳感器，可用于對蛋白質(zhì)激酶A的寬范圍和高靈敏檢測。