本發明提供了一種開關型鋅離子熒光探針及其制備方法和應用，其結構為：該探針以羅丹明染料為發光團，識別基團對鋅離子具有專一的選擇性和較高的靈敏度，通過羅丹明開關環使得探針與鋅離子結合后熒光增強96倍。該探針制備方法簡單，適合放大合成和實際應用。能夠用于化學分析檢測領域中細胞內鋅離子的檢測，對于其他生物樣本中鋅離子的檢測具有廣闊的應用前景。

1.一種開關型鋅離子熒光探針，其特征在于：該熒光探針結構如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄分別為H、C1-20烷基、取代烷基、環烷基、取代環烷基、芳基、取代芳基、
(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM、(CH₂)_mSO₃M、雜芳基或取代雜芳基中的一種或二種以上；
n、m 分別為0-12的整數；
M 為H、K、Na、Li、NH₄、NH₃R₅、NH₂(R₅)₂、NH(R₅)₃ 或N(R₅)₄；
R₅為H、C1-20烷基。
2.一種權利要求1所述的開關型鋅離子熒光探針的制備方法，其特征在于：具體步驟如
下：
（1）中間體N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺的合成
2-氨基-6-甲基吡啶和有機堿溶于二氯甲烷中，將新戊酰氯緩慢滴入反應瓶，冰水浴中
反應1-3小時，再于室溫中反應2-6小時；反應結束后用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗，
有機相干燥、旋干后得到N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；
（2）中間體N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺的合成
N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺溶于四氯化碳，加入偶氮二異丁腈引發劑，氮氣保
護下加入N-溴代丁二酰亞胺，回流狀態下反應3-8小時，反應結束后柱分離得到目標中間體
N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；
（3）中間體N-（6-（二吡啶甲基芐胺）吡啶）-2,2-二甲基戊酰胺的合成
無水無氧條件下，N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺、相對于N-(6-溴甲基吡啶)-
2,2-二甲基戊酰胺0.8-1倍摩爾量的二甲基吡啶胺、堿和相轉移催化劑；N-(6-溴甲基吡
啶)-2,2-二甲基戊酰胺與堿和相轉移催化劑的質量比為1:1-1.5:0.01-0.05；在相對于N-
(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺10-20倍質量的乙腈中以81-82℃回流24-48小時；反應
結束后降至室溫，加入相對乙腈體積0.2-0.6倍體積的1M的氫氧化鈉溶液，用二氯甲烷萃取
三到五次，合并有機相，干燥后旋干有機相，通過柱分離得到目標中間體N-（6-（二吡啶甲基
芐胺）吡啶）-2,2-二甲基戊酰胺；
（4）中間體6-（二吡啶甲基芐胺）-2-氨基吡啶的合成
N-（6-（二吡啶甲基芐胺）吡啶）-2,2-二甲基戊酰胺加入酸溶液，100-110℃回流24-48
小時，反應結束后加入1M氫氧化鈉溶液，調節pH > 8；二氯甲烷萃取，合并有機相，干燥，旋
干，用少量乙醚洗，得到目標中間體6-（二吡啶甲基芐胺）-2-氨基吡啶；
（5）鋅離子熒光探針的合成
羅丹明染料溶于20-30倍質量的1,2-二氯乙烷，加入相對于羅丹明1-1.2倍摩爾量的氯
化試劑在83-90℃回流反應3-8小時后，旋干反應液，得到酰氯化羅丹明粗產物；6-（二吡啶
甲基芐胺）-2-氨基吡啶、酰氯化羅丹明溶于干 燥乙腈，在有機堿催化下室溫反應12-24小
時；反應結束后旋干反應液；
（6）鋅離子熒光探針的提純
將粗產物通過中性硅膠柱或中性氧化鋁柱分離提純得到目標鋅離子熒光探針。
3.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(1)中所
述的有機堿為三乙胺、吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶中至少一種；所述有機相為二氯甲烷溶
液；
步驟（1）中，2-氨基-6-甲基吡啶、新戊酰氯和有機堿之間物質的量之比為1:1-1.5:1-
1.6，二氯甲烷質量為2-氨基-6-甲基吡啶質量的60-120倍。
4.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(2)中所
述的柱分離采用硅膠分離柱，所用溶劑為二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、三乙胺、
冰醋酸中的一種或二種以上。
5.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(3)中所
述的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銨、三乙胺、吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶、N，N-二異丙基乙胺
中的一種；步驟(3)中所述的相轉移催化劑為芐基三乙基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基氯
化銨、四丁基硫酸氫銨、三辛基甲基氯化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基氯化
銨中的一種。
6.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(3)中所
述的柱分離采用中性硅膠或中性氧化鋁分離柱，所用洗脫劑為二氯甲烷、石油醚、乙酸乙
酯、氯仿、甲醇、三乙胺、冰醋酸中的一種或二種以上。
7.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(4)中所
述的酸溶液指1-3 M鹽酸溶液或1-3 M硫酸溶液；
步驟（4）中， 酸溶液的質量為N-（6-（二吡啶甲基芐胺）吡啶）-2,2-二甲基戊酰胺質量
的600-1200倍。
8.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(5)中所
述的氯化試劑指三氯氧磷、二氯亞砜、草酰氯中的一種；步驟(5)中所述的有機堿為三乙胺、
吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶中至少一種；
步驟（5）中 酰氯化羅丹明與6-（二吡啶甲基芐胺）-2-氨基吡啶物質的量比為1:0.8-
1.1；6-（二吡啶甲基芐胺）-2-氨基吡啶與有機胺和乙腈的質量比為1: 1.5-3:200-300。
9.按照權利要求2所述的開關型鋅離子熒光探針的合成方法，其特點是：步驟(6)中所
述的柱分離采用中性氧化鋁柱，分離溶劑為二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、三乙
胺、冰醋酸中的一種或二種。
10.權利要求1所述的開關型鋅離子熒光探針在pH=7.4溶液中鋅離子的檢測中的應用，
所述應用是非疾病診斷，或非疾病治療的。