本發(fā)明提供了基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。首次利用免標(biāo)記銀納米探針發(fā)展了一種簡(jiǎn)便但靈敏度好、選擇性高的酶反應(yīng)比色檢測(cè)方法。用此比色方法，可以通過銀納米探針顏色的變化來監(jiān)測(cè)牛小腸堿性磷酸酶催化的去磷酸化反應(yīng)和牛心蛋白激酶A催化的磷酸化反應(yīng)。該方法對(duì)牛小腸堿性磷酸酶的檢測(cè)限為1unit/mL，對(duì)牛心蛋白激酶A的檢測(cè)限為0.022unit/mL。尤為重要的是，該方法還可用于酶活性抑制的分析和復(fù)雜生物樣品中酶含量的檢測(cè)。本發(fā)明的方法具有的簡(jiǎn)單、靈敏、便宜等優(yōu)點(diǎn)外，且用銀納米而不是金納米作為比色探針，進(jìn)一步拓寬了比色傳感器的研究和應(yīng)用范圍。

1.基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定牛小腸堿性磷酸酶的方法，其步驟如下：(1)參考Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely?stable?water-soluble?Ag?nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635所述的方法合成銀納米探針；(2)將5mM三磷酸腺苷和牛小腸堿性磷酸酶加入到反應(yīng)緩沖溶液中，混合均勻，37℃水浴反應(yīng)20min；所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小腸堿性磷酸酶∶反應(yīng)緩沖溶液的體積比為1∶1∶4；所述的反應(yīng)緩沖溶液為含1mM?MgCl₂的pH?9.0的50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；所述的牛小腸堿性磷酸酶濃度為0.001unit/μL到0.1unit/μL；若進(jìn)行比色反應(yīng)的特異性測(cè)定，將牛小腸堿性磷酸酶替換為25μM牛血清白蛋白、或10μMα-凝血酶、或2.1μM胰蛋白酶即可；(3)向(2)中的反應(yīng)液中加入銀納米探針和0.5M?NaCl水溶液；所述的5mM三磷酸腺苷∶銀納米探針∶0.5M?NaCl水溶液的體積比為1∶40∶3；(4)將(3)中反應(yīng)液，與水混合均勻，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化，完成基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定牛小腸堿性磷酸酶的方法；所述的(3)中反應(yīng)液∶水的體積比為1∶3。2.基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶，具體涉及測(cè)定抑制劑對(duì)牛小腸堿性磷酸酶活性的抑制的方法，其步驟如下：(1)參考Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely?stable?water-soluble?Ag?nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635所述的方法合成銀納米探針；(2)將1unit/μL牛小腸堿性磷酸酶與Na₃VO₄混合均勻，37℃水浴反應(yīng)10min；所述的1unit/μL牛小腸堿性磷酸酶∶Na₃VO₄的體積比為1∶1；所述的Na₃VO₄濃度為0.5微摩爾每升到100毫摩爾每升；(3)將5mM三磷酸腺苷加入到(2)的反應(yīng)液中，混合均勻，37℃水浴反應(yīng)20min；所述的1unit/μL牛小腸堿性磷酸酶∶5mM三磷酸腺苷的體積比為1∶1；(4)向(3)中的反應(yīng)液中加入銀納米探針和0.5M?NaCl水溶液；所述的5mM三磷酸腺苷∶銀納米探針∶0.5M?NaCl水溶液的體積比為1∶40∶3；(5)將(4)中反應(yīng)液，與水混合均勻，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化，完成基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定抑制劑對(duì)牛小腸堿性磷酸酶活性的抑制的方法；所述的(4)中反應(yīng)液∶水的體積比為1∶3。3.基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定生物樣品中牛小腸堿性磷酸酶的含量的方法，其步驟如下：(1)參考Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely?stable?water-soluble?Ag?nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635所述的方法合成銀納米探針；(2)將牛小腸堿性磷酸酶和1％胎牛血清混合，得到生物流體中牛小腸堿性磷酸酶樣品；所述的牛小腸堿性磷酸酶∶1％胎牛血清的體積比為1∶1；(3)向(2)中含牛小腸堿性磷酸的1％胎牛血清中加入5mM三磷酸腺苷和反應(yīng)緩沖溶液，混合均勻，37℃水浴反應(yīng)10min；所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小腸堿性磷酸酶∶反應(yīng)緩沖溶液的體積比為4∶1∶7；所述的反應(yīng)緩沖溶液為含1mM?MgCl₂的pH?9.0的50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；(4)向(3)中的反應(yīng)液中加入銀納米探針和0.5M?NaCl水溶液；所述的5mM三磷酸腺苷∶銀納米探針∶0.5M?NaCl水溶液的體積比為1∶40∶3；(5)將(4)中反應(yīng)液，與水混合均勻，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化，完成基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定生物樣品中牛小腸堿性磷酸酶的含量的方法；所述的(4)中反應(yīng)液∶水的體積比為1∶3。4.基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定牛心蛋白激酶A的方法，其步驟如下：(1)參考Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely?stable?water-soluble?Ag?nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635所述的方法合成銀納米探針；(2)將2mM多肽底物、1mM環(huán)單磷酸腺苷、1mM?MgCl₂水溶液、10mM三磷酸腺苷和不同濃度牛心蛋白激酶A混合均勻，37℃水浴反應(yīng)2h；所述的2mM多肽底物∶1mM環(huán)單磷酸腺苷∶1mM?MgCl₂水溶液、∶10mM三磷酸腺苷∶牛心蛋白激酶A的體積比為4∶1∶1∶1∶2；所述的多肽底物序列為H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-OH；所述牛心蛋白激酶A的濃度為0.022unit/mL到22unit/mL；(3)向(2)中的反應(yīng)液中加入銀納米探針，30℃水浴反應(yīng)10min；所述的(2)中的反應(yīng)液∶銀納米探針的體積比為1∶10；(4)將(3)中反應(yīng)液，與水混合均勻，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化，完成基于銀納米探針無標(biāo)記比色測(cè)定酶的方法，具體涉及測(cè)定牛心蛋白激酶A的方法；所述的(3)中反應(yīng)液∶水的體積比為1∶8。