本發(fā)明屬于精細(xì)化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙光子熒光pH探針的制備方法及其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用，所述探針以雙氰基二苯乙烯為母體制備，結(jié)構(gòu)中包含咔唑基、雙氰基、正辛基。該探針的分子結(jié)構(gòu)中由于含有較長(zhǎng)的柔性鏈，具有較強(qiáng)的親脂性，能穿透細(xì)胞壁(或細(xì)胞膜)進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而檢測(cè)細(xì)胞中的pH；并且屬于D?π?A型分子，提高了雙光子吸收截面(δ)，使探針具有較高的成像清晰度與分辨率；另外在標(biāo)記過(guò)程中擁有超大斯托克斯位移，大大提高了成像準(zhǔn)確度與精密度，并且本發(fā)明探針在溶劑中熒光量子產(chǎn)率(Φ)較高，雙光子發(fā)射截面較大，則成像的亮度越高，自然越清晰、分辨率也越高。

1.雙光子熒光標(biāo)記探針D1在制備用于探測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH水平、細(xì)胞異常信息的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述雙光子熒光標(biāo)記探針D1具有以下分子結(jié)構(gòu)： 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙光子熒光標(biāo)記探針D1的應(yīng)用，其特征在于：所述的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙光子熒光標(biāo)記探針D1的應(yīng)用，其特征在于：將D1溶于生理鹽水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯60蓖麻油組成的混合溶液中，簡(jiǎn)稱MIS溶液，采用HEPES即4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，在培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞后的培養(yǎng)基中加入1μmol﹒L^-1熒光探針，并在30-40℃、含2-10％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵化20-50min，取出細(xì)胞并用緩沖溶液PBS沖洗3-4次，并于無(wú)色血清游離介質(zhì)中再孵化10-20min，然后用共聚焦激光掃描顯微鏡：λ_ex＝800nm,～1.5W、20倍目鏡將射入的激光共聚焦于細(xì)胞上，收集600～650nm通道的熒光，由此獲得細(xì)胞pH水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞是否異常的監(jiān)測(cè)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述生理鹽水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯60蓖麻油即CrEL的體積比為20：35：30：15。