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利用可視薄膜感受器芯片檢測特異核苷酸序列的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2022-01-23
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN200710109479.2 
  • 技術(專利)名稱 利用可視薄膜感受器芯片檢測特異核苷酸序列的方法 
  • 項目單位 鄧興旺
  • 發明人 鄧興旺,白淑蘭,鐘曉波,魏寧 
  • 行業類別 其他領域
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 錢文彤
  • 發布時間 2022-01-23  
  • 01

    項目簡介

    本發明提供了一種利用可視薄膜感受器芯片技術檢測特異核苷酸序列和SNP標記(或點突變)的方法。將特異序列的單鏈寡核苷酸作為捕捉探針通過乙醛共價結合于肼衍生的感受器芯片表面;然后通過生物素標記的PCR產物與捕捉探針雜交,可以鑒定特異的DNA序列,或者捕捉探針、在生物素標記的檢測探針和PCR產物同時進行雜交和連接反應,可以鑒定位點突變序列(如SNP位點);最后將芯片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體溫育,加底物顯色,如果PCR產物中存在特異目標序列,那么芯片的表面會有肉眼可辨的顏色變化,金色變為藍色或紫色。這項檢測技術快速、準確、低廉、靈敏度高、特異性強,并且低通量和高通量可自由選擇,非常經濟實惠。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種利用可視薄膜感受器芯片檢測SNP位點或點突變的方法,包括以下步驟:1)將一對特異序列的單鏈寡核苷酸捕捉探針P1通過乙醛共價結合于肼衍生的可視薄膜感受器芯片表面的不同點樣點,所述P1探針從5’到3’端依次是10-12個脫氧腺嘌呤殘基和35-50個脫氧核苷酸殘基組成的序列,兩個P1探針的3’末端脫氧核苷酸殘基分別與SNP或點突變的不同等位基因相對應,其余的34-49個脫氧核苷酸殘基組成的序列互補于靶基因中相關SNP或點突變位點一側的相鄰序列;2)合成一個P2探針,P2探針互補于SNP或點突變位點另一側的相鄰序列,其3’端有生物素標記,5’端帶有磷酸基;3)PCR擴增待測樣品的目標DNA序列;4)在共價結合了P1探針的芯片上加P2探針和變性后的PCR產物,在熱穩定連接酶的存在下同時進行DNA雜交反應和P1-P2連接反應,而且其中先在芯片上加P2探針和變異Ampligase,在含20mM?Tris-HCl,pH?8.3,25mM?KCl,10mM?MgCl2,0.5mM煙酰胺腺苷酸二核苷酸,0.01%Triton?X-100和5mg/ml酸解酪蛋白的連接反應體系中55-65℃預熱,然后加入變性后的PCR產物,于55-65℃同時進行DNA雜交反應和P1-P2連接反應,其中所述變異Ampligase是帶有Lys294Arg的T.thermophillus連接酶;5)用0.01M的NaOH?60℃嚴格洗滌芯片,然后用0.1×SSC溶液室溫洗滌芯片;6)芯片與辣根過氧化物酶標記的生物素抗體雜交,洗滌;7)在芯片上加辣根過氧化物酶的底物進行反應,水洗,干燥后觀察結果,芯片表面從金色變為藍色或紫色表明該點樣點的P1探針與樣品的SNP位點或點突變相匹配;而且步驟1)具體通過下列步驟實現:1-1)利用旋轉涂布方式在構成可視薄膜感受器芯片的薄膜硅質基片表面涂布145埃T型聚氨基堿性聚二甲基硅氧烷,然后將含有聚(苯丙氨酸-賴氨酸)的芯片在含1-10μM的琥珀酰亞氨基煙酸沙星的pH8.2的0.1M硼酸鈉溶液中處理2小時,去離子水洗干凈,備用;1-2)合成一對捕捉探針P1,從5’到3’端依次是10-12個脫氧腺嘌呤殘基和35-50個脫氧核苷酸殘基組成的序列,兩個P1探針的3’末端脫氧核苷酸殘基分別與SNP或點突變的不同等位基因相對應,其余的34-49個脫氧核苷酸殘基組成的序列互補于靶基因中相關SNP或點突變位點一側的相鄰序列,用乙醛基團修飾P1探針的5’端;1-3)將5’端帶有乙醛基團的一對P1探針稀釋為不同濃度,分別取1-200nl點樣至芯片上的不同位置處,室溫反應2小時后用去離子水浸洗,60℃浸于0.1%SDS中2小時,水洗,干燥。2.如權利要求1所述的檢測SNP位點或點突變的方法,其特征在于,所述步驟6)雜交液為5×SSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液,在雜交液中18-25℃溫育5min后用0.1×SSC溶液室溫洗滌芯片。3.如權利要求1所述的檢測SNP位點或點突變的方法,其特征在于,所述步驟7)所用的辣根過氧化物酶的底物為四甲基聯苯胺,室溫反應5min。
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