本發(fā)明公開了一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是將三角帆蚌外套膜組織進(jìn)行原位雜交，根據(jù)外套膜組織原位雜交的結(jié)果對(duì)目的基因進(jìn)行基因定位，所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對(duì)目的基因的探針，所述的目的基因的序列如SEQIDNo.1所示，所述的探針的序列如SEQIDNo.2所示。本發(fā)明為三角帆蚌外套膜參與的成殼和育珠研究提供了基因定位的方法，也為進(jìn)一步研究三角帆蚌生長(zhǎng)和育珠過程中各種分子機(jī)制提供了一種技術(shù)手段。本發(fā)明的方法易于操作，節(jié)省時(shí)間，無需特殊設(shè)備，成本較低。本發(fā)明對(duì)養(yǎng)殖中提高淡水珍珠質(zhì)量的研究有重要意義。

1.一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是將三角帆蚌外套膜組織進(jìn)行原位雜交，根據(jù)外套膜組織原位雜交的結(jié)果對(duì)目的基因進(jìn)行基因定位，其特征在于，所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對(duì)目的基因的探針，所述的目的基因的序列如SEQ?ID?No.1所示，所述的探針的序列如SEQ?ID?No.2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的外套膜組織原位雜交包括以下步驟：（1）將三角帆蚌外套膜組織進(jìn)行固定；（2）將固定好的外套膜組織進(jìn)行切片；（3）將組織切片進(jìn)行預(yù)處理；（4）將預(yù)處理后的組織切片進(jìn)行雜交；（5）雜交后的處理與檢測(cè)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟（1）是將三角帆蚌外套膜組織用4%多聚甲醛溶液在溫度4℃下固定24?h，然后用DEPC水配制的1×PBS溶液洗滌組織。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的4%多聚甲醛溶液的溶質(zhì)為多聚甲醛，溶劑為PBS，多聚甲醛的終濃度質(zhì)量百分含量為4%，所述的PBS的制備方法為：NaCl?8?g、KCl?0.2?g、Na₂HPO₄?1.44?g、KH₂PO₄?0.24g，用DEPC-H₂O?配至1?L，調(diào)pH值至7.4。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟（2）是將固定后的外套膜組織切成厚度為7～10?μm的組織切片，并將烘烤后的切片保存于4℃冰箱。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步驟（3）中所述的預(yù)處理按照如下步驟進(jìn)行：（a）將組織切片分別進(jìn)行第一次二甲苯脫蠟5?min、第二次二甲苯脫蠟5?min、二甲苯和酒精的等量混合液脫蠟5?min；（b）然后依次經(jīng)過第一次無水乙醇清洗10?min、第二次無水乙醇清洗10?min、95%乙醇清洗5?min、90%乙醇清洗5?min、80%乙醇清洗5?min、70%乙醇清洗5?min、1×PBS溶液清洗10?min；（c）然后再依次經(jīng)過Triton?X-100清洗10?min、1×PBS溶液清洗10?min、37℃下含5?μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15?min、質(zhì)量百分含量為0.2%甘氨酸溶液清洗5?min、第一次1×PBS溶液清洗5?min、第二次1×PBS溶液清洗5?min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5?min；（d）固定后再用1×PBS溶液清洗兩次，每次均清洗5?min，組織切片放入55℃去離子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30?min。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步驟（4）中所述的雜交條件為：雜交液中加入終濃度為1.0?μg/mL的探針，混合均勻，75℃加熱5?min后，冰上急冷，然后將雜交液滴片到組織切片上，于55℃的雜交爐中孵育16～20?h。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟（5）按照如下步驟進(jìn)行：（a）雜交后的組織切片用甲酰胺和1×SSC的等量混合液于55℃下洗滌兩次，每次均洗滌30?min；（b）組織切片用NTE?Buffer于37℃下洗滌10?min，然后用加有終濃度為20?μg/mL的RNase?A的NTE?Buffer溶液于37℃下洗滌30?min，再用NTE?Buffer于37℃下洗滌10?min；所述的NTE?Buffer的具體成分為：500?mmol/L?NaCl，10?mmol/L?Tris，1?mmol/L?EDTA，pH?8.0。（c）分別用1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于37℃下各洗滌一次，每次均為10?min；（d）用1×PBS溶液于37℃下洗滌切片5?min，再將組織切片浸入Blocking?solution溶液中，室溫浸泡1?h，然后浸入1%?BSA溶液中，室溫浸泡30?min；（e）按1:2000的抗體效價(jià)，在Blocking?solution溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，將組織切片浸入其中，室溫浸泡2?h；（f）將經(jīng)過抗體孵育后的組織切片用Wash?solution室溫洗滌2次，每次洗滌20?min；（g）再將切片浸入Detection?solution溶液中，室溫浸泡3?min；（h）然后將切片放于NBT/BCIP反應(yīng)液中避光孵育12～16?h，在此過程中觀察切片呈色強(qiáng)度；（i）當(dāng)顯色完全后，將切片用1×PBS溶液室溫清洗10?min；（j）最后將切片經(jīng)過二甲苯脫色，用中性樹脂封片，觀察，拍照。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的三角帆蚌為健康3齡三角帆蚌。