本發(fā)明公開了一種梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟：①、待鑒定樣品基因組DNA的提取；②、實時熒光定量PCR擴增體系設置：以基因組DNA為擴增模板，用特異性引物和探針，進行實時熒光PCR檢測；③、擴增結果分析及結果判斷。探針為：Probe：5’?(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)?3’。本發(fā)明能用于有效地從蛀果性害蟲(包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟等)中區(qū)分出梨小食心蟲。

1.梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
檢測中所用特異性引物和探針的核苷酸分別為：
特異性引物為：
F-Primer:5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’
R-Primer:5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’；
探針為：
Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是包括以下步驟：
①、待鑒定樣品基因組DNA的提取；
②、實時熒光定量PCR擴增體系設置：
以基因組DNA為擴增模板，用上述特異性引物和探針，進行實時熒光PCR檢測；
③、擴增結果分析及結果判斷。
3.根據(jù)權利要求2所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
探針的5’端標記有報告熒光染料，根據(jù)所采用的實時熒光PCR儀的配置而定，所述報告
熒光染料為FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5，探針的3’端標記有淬滅熒光染料，所述
淬滅熒光染料為TAMRA、ROX、dabcy1、BHQ或ECLIPSE。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
所述步驟②實時熒光定量PCR擴增體系設置為：
25μL總體積中含有10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM、each的dNTP2μL，10μM的上下游引物
各0.5μL，10μM的探針0.5μL，500U Taq DNA聚合酶0.25μL和DNA模板2μL，補水至25μL。
5.根據(jù)權利要求4所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
實時熒光PCR擴增條件為：95℃預處理15s，再以95℃變性5s，60℃退火/延伸34s，進行
40個循環(huán)，在每個循環(huán)的60℃退火/延伸階段收集熒光信號。
6.根據(jù)權利要求5所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
所述步驟③的擴增結果分析及結果判斷為：根據(jù)樣品擴增出具有指數(shù)增長型的熒光擴
增曲線，當其Ct值小于35，且陰性對照和空白對照無熒光信號，說明該樣品受到梨小食心蟲
污染，否則不是梨小食心蟲污染；當檢測樣品Ct值小于35，但陰性對照/空白對照有熒光信
號，說明該檢測結果不可信，整個檢測過程需要重新做。
7.根據(jù)權利要求6所述的梨小食心蟲實時熒光PCR檢測方法，其特征是：
所述步驟①的梨小食心蟲待檢樣品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法或
試劑盒法進行提取。