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一株重組大腸桿菌及其在發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-01
  • 技術成熟度:通過中試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201510829212.5 
  • 技術(專利)名稱 一株重組大腸桿菌及其在發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用 
  • 項目單位 山東大學
  • 發明人 王書寧,黃海燕,胡烈杰,于文君,李慧俐,袁恒星 
  • 行業類別 醫藥制造-化學藥品制劑
  • 技術成熟度 通過中試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 周西社
  • 發布時間 2021-12-01  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一株重組大腸桿菌,所述菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet?S33[2Fe2S]Fd,該菌株含有來源于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述重組大腸桿菌是將[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet?1載體,制得重組質粒命名為pETDuet?[2Fe2S],并將制得的重組質粒轉入含有pCodonPlus和pRKISC質粒的E.coli C41(DE3)中獲得。本發明還公開了所述重組大腸桿菌在發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用,實驗證實:每升發酵培養物最終可以獲得23mg純化后的[2Fe2S]鐵氧還蛋白,遠大于之前報道的從野生菌中純化出來的0.03mg的產量,預示本發明提供的重組大腸桿菌在工業化生產中具有很好的應用前景。
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  • 02

    說明書

    1.一株重組大腸桿菌發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白的方法,步驟是:(1)構建高效表達[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌,將重組大腸桿菌菌株以體積比1~5%的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源的TB培養基中培養,獲得菌液;其中,上述TB培養基的配方及組分終濃度是:Tryptone 12g/L,Yeast extract 24g/L,Glycerol 4ml/L,KH2PO4 2.3g/L,K2HPO4 12.5g/L;上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素,終濃度為10μg/ml的四環素,終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素;(2)向制得的菌液中加入終濃度為0.5mM的IPTG,在35~37℃和180rpm轉速下誘導10~24小時,收集培養液離心,獲得含[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細胞;(3)破碎細胞,分離純化制備[2Fe2S]鐵氧還蛋白;其特征在于:上述重組大腸桿菌菌株的構建方法是將來源于根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體,制得重組質粒命名為pETDuet-[2Fe2S],并將制得的重組質粒轉入含有pCodonPlus和pRKISC質粒的E.coli C41(DE3)中獲得;該重組大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd,其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因;上述重組大腸桿菌菌株是在37±1℃和180±10rpm轉速條件下培養2~3小時至OD620nm為0.4~0.6,獲得菌液;上述鐵硫源配方及組分終濃度是:檸檬酸鐵銨0.2-0.3g/L,L-半胱氨酸0.1-0.2g/L,檸檬酸鐵0.18-0.3g/L,FeSO4·7H2O 0.25-0.4g/L。
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