本發(fā)明公開了一種催化生產(chǎn)1,5?戊二胺的工程菌及其應用。本發(fā)明公開的一種工程菌，是在大腸桿菌B株或其衍生菌株中過表達賴氨酸脫羧酶基因，同時適量表達賴氨酸?戊二胺逆向轉運蛋白基因cadB。本發(fā)明公開的工程菌是在大腸桿菌B系列衍生菌株中過量表達賴氨酸脫羧酶基因cadA并同時適量表達賴氨酸?戊二胺逆向轉運蛋白基因cadB構建的1,5?戊二胺全細胞催化工程菌；本發(fā)明進一步公開了利用該工程菌催化生產(chǎn)1,5?戊二胺的方法，該方法可以實現(xiàn)高轉化率、高生產(chǎn)強度和高產(chǎn)量地催化產(chǎn)生1,5?戊二胺，降低了1,5?戊二胺的生產(chǎn)成本，從而在實踐上可用于1,5?戊二胺大規(guī)模生產(chǎn)，便于推廣應用。

1.一種工程菌，是在大腸桿菌B株或其衍生菌株中過表達賴氨酸脫羧酶基因，同時表達
賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白基因cadB；
所述賴氨酸脫羧酶基因為cadA；
所述在大腸桿菌B株或其衍生菌株中過表達賴氨酸脫羧酶基因，同時表達賴氨酸-戊二
胺逆向轉運蛋白基因cadB的方法為如下(1)或(2)所示：
(1)將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因和包含RBS22的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白
編碼基因的片段導入所述大腸桿菌B株或其衍生菌株中；
所述片段是通過重組表達載體導入的；
所述重組表達載體是將所述片段插入pET28a(+)的多克隆位點間得到的；
所述重組表達載體構建過程如下：將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段插入
pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位點間，得到重組表達載體1；再將包含RBS22的賴氨酸-戊
二胺逆向轉運蛋白編碼基因的片段插入重組表達載體1的Not I和Hind III位點間得到；
所述賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述RBS22的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第7255位至第7263位核苷酸所
示；
(2)將所述大腸桿菌B株或其衍生菌株的cadBA操縱子的啟動子替換為適用于大腸桿菌
的能解除cadB轉錄阻遏的啟動子，再將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段導入所述
大腸桿菌B株及其衍生菌株中；
所述將大腸桿菌B株或其衍生菌株的cadBA操縱子的啟動子替換為T7啟動子的過程如
下：將帶有T7啟動子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的編碼基因的質粒導入所述大腸
桿菌B株或其衍生菌株中進行同源重組得到；
所述帶有T7啟動子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的編碼基因的質粒是將帶有T7
啟動子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的編碼基因插入pKOV質粒的BamHI和Not I位點
間得到；
所述帶有T7啟動子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的編碼基因的核苷酸序列如
SEQ ID No.21所示；
所述含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段是通過重組表達載體導入的；
所述重組表達載體是將所述片段插入pET28a(+)的多克隆位點間得到的；
所述重組表達載體構建過程如下：將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段插入
pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位點間；
所述賴氨酸脫羧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段如SEQ ID No.3所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白的編
碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第7269位至第8603位核苷酸所示；
所述包含RBS22的賴氨酸-戊二胺逆向轉運蛋白編碼基因的片段如SEQ ID No.11所示；
所述賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第
5071位至第7215位核苷酸所示。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述大腸桿菌B株為E.coli BL21
(DE3)。
4.一種制備1,5-戊二胺的方法，包括如下步驟：將權利要求1-3任一所述的工程菌在含
有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；將種子液接入豐富培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)；
加入誘導劑誘導表達，再加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化，即得；
所述誘導劑為IPTG或乳糖；
所述底物賴氨酸為含有賴氨酸生產(chǎn)菌的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體的賴氨酸發(fā)酵液、去
除菌體并脫色的賴氨酸發(fā)酵液、賴氨酸發(fā)酵液的離子交換洗脫液、游離賴氨酸、賴氨酸鹽干
粉或其溶液；
所述維生素B6為吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或鹽酸吡哆醛；
所述豐富培養(yǎng)基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/L K2HPO4·3H2O,
1.14g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,5mL/L微量元素儲液，50mg/L卡那
霉素，余量為水；
所述微量元素儲液含有6g/L FeSO4·7H2O,1.35g/L CaCl2,0.8g/L ZnSO4·7H2O,
1.5g/L MnSO4·4H2O,0.15g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1g/L H3BO3,
0.25g/L CoCl2·6H2O和10mL/L濃鹽酸，余量為水。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：所述LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為5-
200mg/L；
所述種子液的OD600為5-25；
所述種子液接入豐富培養(yǎng)基的比例為0.5-30％；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25℃-45℃；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的DO在50％以上；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的pH為4.0-9.0；
所述IPTG的終濃度為0.01-10mM；
所述IPTG加入的時間為發(fā)酵培養(yǎng)后3-40小時；
所述IPTG誘導時還包括0.5-10g/L的速率補加葡萄糖的步驟；
所述賴氨酸鹽為L-賴氨酸鹽酸鹽；
所述加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化的時間為誘導開始后的0.5-30h；
所述催化過程中pH維持在5.5-7.0之間，用硫酸調(diào)節(jié)；
所述催化還包括如下步驟：按照0-5g/L的速率補加葡萄糖，通氣量為0-10vvm，溫度控
制在25-60℃，攪拌轉速為0-1200rpm。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：所述LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為為
50mg/L；
所述種子液接入豐富培養(yǎng)基的比例為5％；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37℃；
所述IPTG的終濃度為0.4mM；
所述IPTG加入的時間為發(fā)酵培養(yǎng)后3h；
所述速率為3g/L；
所述加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化的時間為誘導開始后的6h。
7.一種制備1,5-戊二胺的方法，包括如下步驟：將權利要求1-3任一所述的工程菌在含
有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；將種子液接入無機鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)；
加入誘導劑誘導表達，再加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化，即得；
所述誘導劑為IPTG或乳糖；
所述底物賴氨酸為含有賴氨酸生產(chǎn)菌的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體的賴氨酸發(fā)酵液、去
除菌體并脫色的賴氨酸發(fā)酵液、賴氨酸發(fā)酵液的離子交換洗脫液、游離賴氨酸以及賴氨酸
鹽干粉或其溶液；
所述維生素B6為吡哆醛、磷酸吡哆醛和鹽酸吡哆醛；
所述無機鹽培養(yǎng)基含有2g/L(NH4)2HPO4,4g/L KH2PO4,0.85g/L檸檬酸,0.7g/L
MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O,2.25mg/L ZnSO4·7H2O,0.2mg/L CuSO4·5H2O,
0.5mg/L MnSO4·5H2O,0.23mg/L NaB4O7·10H2O,2.0mg/L CaCl2·2H2O,0.1mg/L
NH4Mo7O24，0.15mg/L CoCl2·6H2O，余量為水。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于：所述LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為5-
200mg/L；
所述種子液的OD600為5-25；
所述種子液接入無機鹽培養(yǎng)基的比例為0.5-30％；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25℃-45℃；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的DO在50％以上；
所述發(fā)酵培養(yǎng)時葡萄糖的濃度維持在5g/L以下，是通過流加補料液實現(xiàn)的，所述補料
液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量為水；
所述IPTG的終濃度為0.01-10mM；
所述IPTG加入的時間為發(fā)酵培養(yǎng)后5-20h；
所述賴氨酸鹽為L-賴氨酸鹽酸鹽；
所述加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化的時間為誘導開始后的10-24h小時；
所述催化過程中pH維持在4.0-9.0之間，用鹽酸調(diào)節(jié)；
所述催化還包括如下步驟：按照0-5g/L的速率補加葡萄糖，通氣量為0-10vvm，溫度控
制在25-60℃，攪拌轉速為0-1200rpm。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于：述LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為
50mg/L；
所述種子液接入無機鹽培養(yǎng)基的比例為2％；
所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37℃；
所述IPTG的終濃度為0.1mM；
所述IPTG加入的時間為發(fā)酵培養(yǎng)后12h；
述加入底物賴氨酸和維生素B6開始全細胞催化的時間為誘導開始后的15h小時；
所述催化過程中pH維持在6.5。
10.權利要求1-3任一所述的工程菌在制備1,5-戊二胺中的應用。
11.權利要求1-3任一所述的工程菌在催化底物賴氨酸和維生素B6生成1,5-戊二胺中
的應用。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于：所述底物賴氨酸為含有賴氨酸生產(chǎn)菌的
賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體并脫色的賴氨酸發(fā)酵液、賴氨酸發(fā)酵液
的離子交換洗脫液、游離賴氨酸以及賴氨酸鹽干粉或其溶液；
所述維生素B6為吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或鹽酸吡哆醛。
13.根據(jù)權利要求12所述的應用，其特征在于：所述賴氨酸鹽為L-賴氨酸鹽酸鹽。