本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一種在桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)美洲大蠊過敏原蛋白Pera 9的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白，從而避免在不同的表達(dá)系統(tǒng)中(例如細(xì)菌和酵母菌)對(duì)Per a 9過敏原結(jié)構(gòu)造成影響的問題，并提供一種親和層析的方法，解決天然Per a 9過敏原純化工藝復(fù)雜的問題。使用桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)得到的Per a 9蛋白的活性是使用大腸桿菌得到的Per a 9蛋白活性的2.1倍。

1.一種在桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)美洲大蠊過敏原蛋白Per?a?9的方法，其步驟包括：(1)從美洲大蠊組織中提取總RNA；(2)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得美洲大蠊過敏原Per?a?9蛋白的編碼基因，其序列如SEQ?ID?No：1所示；所述PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10分鐘后，94℃30秒變性、50℃45秒退火、72℃1分鐘延伸，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；(3)將Per?a?9蛋白的編碼基因克隆到桿狀病毒載體pFastBacHTA中，轉(zhuǎn)染昆蟲sf-9細(xì)胞，在HyQ液體培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)7天后，收集上清得到P0病毒；將P0代病毒以感染復(fù)數(shù)為1感染sf-9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)腫脹時(shí)收集細(xì)胞，經(jīng)超聲裂解細(xì)胞，離心得到上清液，上Nickel親和柱，用Tris-HC1緩沖液進(jìn)行洗脫，第一次洗脫去非特異性結(jié)合蛋白，第二次洗脫下的蛋白即為Per?a?9蛋白；在所述第一次洗脫步驟中，Tris-HC1緩沖液含300mM?NaC1和體積比為5％的甘油；在所述第二次洗脫步驟中，Tris-HC1緩沖液含300mM?NaC1、250mM咪唑和體積比為5％的甘油；所述Per?a?9蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：2所示。