本發明涉及一種生物工程技術，具體地說是一種利用基因重組病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法：重組慢病毒載體構建；神經干細胞的分離、培養及鑒定；重組病毒轉染NSCs；重組慢病毒轉染NSCs的鑒定；重組病毒轉染NSCs：取傳代3次后的NSCs消化制備成單細胞懸液，接種至培養板中；轉染TH+Brn4基因重組慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，搖晃混勻后將培養板置培養箱中培養，12小時后更換新鮮分化培養基；同時用嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩定轉染的細胞；本發明的優點在于：通過構建目的基因TH和Brn4的慢病毒載體，轉染NSCs后外源性基因能在細胞內穩定表達；分化后產生高比例的TH陽性多巴胺能神經元；Brn4能促進神經營養因子的高表達，且具有抑制細胞凋亡的功能。

1.利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，所述的方法包括如下實施步驟：一、pLV5-TH+Brn4重組慢病毒載體構建：根據pLV5-EF1a-GFP慢病毒表達載體的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全長序列分別為NM_012740和NM_017252的基因，構建pLV5-TH、pLV5-Brn4和pLV5-TH+Brn4慢病毒表達載體，包裝后進行測序鑒定和滴度鑒定；二、神經干細胞的分離、培養及鑒定：神經干細胞的培養方法：在無菌條件下，以孕14d的SD胎鼠腹側中腦組織為原材料，用吸管反復吹打直至為細胞懸液，并經200目尼龍網過濾，收集過濾后的細胞懸液，用基礎培養基清洗3遍后重懸于NSCs培養液中，經細胞計數和活力觀察后，按1×10⁵/ml細胞密度接種于含有10ml NSCs培養液的細胞培養瓶中，置于5％、37℃的CO2培養箱中培養，3天后可見培養瓶內形成懸浮的NSCs球，7天后進行傳代培養；神經干細胞的分離方法：神經干細胞在培養瓶中培養3天后，用低速離心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶進行消化，10min后用含10％FBS的基礎培養液終止消化，通過機械吹打的方式使其分散成單細胞懸液，進行細胞計數后培養瓶中繼續培養；神經干細胞的鑒定方法：取P3代NSCs在傳代時培養液中加入終濃度為5μmol/L的BrdU進行標記，使BrdU整合到神經干細胞DNA中，7天后進行BrdU免疫熒光檢測；另取P3代以后的NSCs亞克隆球用Nestin免疫熒光檢測證明其胚胎源性；將P10代NSCs球接種于預先置入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養板中，加入含10％FBS的DMEM/F12分化培養液進行分化，2周后分別進行MAP-2、GFAP和CNP免疫熒光檢測以證明NSCs的多分化潛能；三、重組病毒轉染NSCs：所述的重組病毒的轉染方法：取P3代NSCs消化制備成單細胞懸液，細胞計數后接種至24孔培養板中，每孔接種4×10⁴個細胞，加入500μl基礎培養液懸浮細胞；細胞共分4組進行轉染，每組6孔：Mock組轉染pLV5-GFP慢病毒陰性對照；TH組轉染pLV5-TH重組慢病毒；Brn4組轉染pLV5-Brn4重組慢病毒；TH+Brn4組轉染pLV5-TH+Brn4重組慢病毒；每孔加入20μl 1×10⁸TU/ml的慢病毒和5μg/ml ploybrene，輕輕搖晃混勻后將培養板置培養箱中培養，12小時后更換新鮮分化培養基；感染72小時后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，同時在培養基中加入1μg/ml嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩定轉染的細胞；7天后對各組形成的NSCs球進行傳代培養；四、重組慢病毒轉染NSCs的鑒定，包括：轉染效率檢測是將轉染后的NSCs球接種至預涂有多聚賴氨酸圓蓋片的24孔板中，加入含2％FBS的DMEM/F12分化培養液，分化培養1周后終止培養，吸去培養液，加入4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察結果；TUNEL法細胞凋亡檢測是將各組NSCs分化培養2周后，吸去各孔中的培養液，用0.01M PBS清洗3遍，然后用含4％多聚甲醛的0.1PBS室溫下固定20min,吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用TUNEL凋亡檢測試劑盒按操作說明進行細胞凋亡檢測,最后PBS洗片3遍后，在避光條件下，加入Hoechst33342，室溫濕盒孵育30min,PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置熒光顯微鏡下觀察TUNEL、Hoechst陽性細胞核并攝片；用統計方法對各組數據進行方差分析和組間比較；高效液相色譜法檢測分化培養液中DA含量是將各組取NSCs分化培養液1ml，加入0.1mol/L過氯酸酸化培養液，14000rpm離心15min，取上清過濾后行高效液相色譜測定，色譜條件：色譜柱為Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，柱溫40℃；流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液比例為97:3；流速為1.0ml/min；檢測器為SPD-20A型紫外檢測器，檢測波長280nm。2.利用權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法獲得一種轉染pLV5-TH+Brn4重組慢病毒的神經干細胞，其特征在于：是將權利要求1中所述的實施步驟三中獲得的穩定轉染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成單細胞懸液，用基礎培養液將細胞配成2×10⁶/ml，加入1.5ml細胞凍存管中，同時加入0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞砜，混勻后密封，置4℃1小時，-20℃2小時，然后直接放入-80℃超低溫冰箱中保存獲得。3.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于：所述的重組慢病毒轉染NSCs的鑒定還包括：Western Blot檢測、免疫熒光細胞化學檢測，所述的Western Blot檢測是將各組轉染后的NSCs球接種至24孔板中進行分化，另設一組未轉染的NSCs作為對照組，分化培養2周后終止培養，按RIPA裂解液說明書的要求，提取各組中細胞的蛋白，用10％SDS-PAGE垂直電泳對蛋白進行分離，Bio-Rad半干轉印系統轉膜15V，50min，5％脫脂奶粉封閉后分別加入下列一抗：小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗TH抗體、兔抗Brn4抗體、兔抗GDNF抗體、兔抗GFRα-1抗體、兔抗RET抗體，室溫孵育2h，4℃過夜，次日分別加入辣根過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG二抗，室溫孵育4h，然后進行曝光、顯影并用所采集圖像，用圖像分析軟件對Western blot結果進 行平均光密度分析，并用統計的方法對各組數據進行方差分析和組間比較；所述的免疫熒光細胞化學檢測是各組NSCs分化2周后終止培養，對陰性對照組和各重組病毒轉染組中細胞進行免疫熒光檢測，簡述如下：所用一抗分別為：小鼠抗TH、大鼠抗DAT；二抗為：結合有Alexa Fluor 568的山羊抗鼠IgG；一抗于4℃孵育過夜，二抗室溫下孵育2h，隨后用Hoechst33342進行細胞核染色30min，中間各步驟之間均用0.01M PBS進行常規洗片，最后用20％甘油緩沖液封片，并在FV10i智能型激光共聚焦顯微鏡下觀察TH或DAT的表達情況，并計算GFP/TH和GFP/DAT雙標細胞占Hoechst標記細胞的百分比，并用統計方法對各組數據進行方差分析和組間比較。4.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于：所述的NSCs培養液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF組成。5.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于：所述的慢病毒的感染復數為50。