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微生物發酵生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖鹽的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-21
  • 技術成熟度:詳情咨詢
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201710217322.5 
  • 技術(專利)名稱 微生物發酵生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖鹽的方法 
  • 項目單位 孫鑭
  • 發明人 孫鑭 
  • 行業類別 醫藥制造-化學藥品制劑
  • 技術成熟度 詳情咨詢
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 王占奇
  • 發布時間 2021-12-21  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了通過微生物發酵生產N?乙酰?D?氨基葡萄糖和D?氨基葡萄糖鹽的方法。該方法主要通過提高微生物中N?乙酰?D?氨基甘露糖?6?磷酸異構酶的作用,以更高效率和更高產量生產N?乙酰?D?氨基葡萄糖和/或D?氨基葡萄糖鹽。
    展開
  • 02

    說明書

    1. 一種通過微生物發酵生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖鹽的方法,該方法包括:A)在發酵培養基中培養微生物,微生物用包含編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列的重組核酸分子轉化,編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列含有增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的酶活性的遺傳修飾,所述遺傳修飾為在對應于氨基酸序列SEQ ID NO:17的第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被組氨酸取代;和B)收集從培養步驟A)中產生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。2.如權利要求1所述的方法,其中,編碼所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列為SEQ ID NO:26。3.如權利要求1所述的方法,其中,重組核酸分子中編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的基因拷貝數增加。4.權利要求1所述的方法,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。5.權利要求4所述的方法,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。6.如權利要求1所述的方法,其中,所述微生物進一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種:(1)包含至少一種能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾,并同時包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾;(2)包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾,并同時包含至少一種能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾;(3)包含至少一種能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾。7.如權利要求6所述的方法,其中,提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性增加;和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶被過量表達。8.如權利要求7所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。9.如權利要求7所述的方法,其中,微生物用至少一種包含編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的核酸序列的重組核酸分子轉化。10.如權利要求9所述的方法,其中,編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的核酸序列含有至少一種增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性的遺傳修飾。11.如權利要求10所述的方法,其中,重組核酸分子中編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因拷貝數增加。12.如權利要求10所述的方法,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。13.如權利要求12所述的方法,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。14.如權利要求7所述的方法,其中,微生物包括至少一種對編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。15.如權利要求14所述的方法,其中,編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。16.如權利要求15所述的方法,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。17.如權利要求6所述的方法,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低;和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表達減少。18.如權利要求17所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。19.如權利要求18所述的方法,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。20.如權利要求19所述的方法,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的內源性天然啟動子完全缺失,即被刪除。21.如權利要求6所述的方法,其中,提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加;和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被過量表達。22.如權利要求21所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。23.如權利要求21所述的方法,其中,微生物用至少一種包含編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重組核酸分子轉化。24.如權利要求23所述的方法,其中,編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一種增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遺傳修飾。25.如權利要求24所述的方法,其中,重組核酸分子中編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷貝數增加。26.如權利要求24所述的方法,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。27.如權利要求26所述的方法,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。28.如權利要求21所述的方法,其中,微生物包括至少一種對編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。29.如權利要求28所述的方法,其中,編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。30.如權利要求29所述的方法,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。31.如權利要求6所述的方法,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性降低;和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的表達減少。32.如權利要求31所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。33.如權利要求32所述的方法,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。34.如權利要求33所述的方法,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶基因的內源性天然啟動子完全缺失,即被刪除。35.如權利要求6所述的方法,其中,提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的酶活性增加;和/或b)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶被過量表達。36.如權利要求35所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。37.如權利要求35所述的方法,其中,微生物用包含編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列的重組核酸分子轉化,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列含有增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的酶活性的遺傳修飾,所述遺傳修飾為在對應于氨基酸序列SEQ ID NO:43的第34位半胱氨酸被絲氨酸取代、第145位組氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位纈氨酸被甘氨酸取代。38.如權利要求37所述的方法,其中,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列為SEQ ID NO:49。39.如權利要求37所述的方法,其中,重組核酸分子中編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因拷貝數增加。40.如權利要求37所述的方法,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。41.如權利要求40所述的方法,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。42.如權利要求35所述的方法,其中,微生物包括至少一種對編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。43.如權利要求42所述的方法,其中,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。44.如權利要求43所述的方法,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。45.如權利要求1-44任一項所述的方法,其中,所述微生物進一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種:(1)包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾;(2)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾;(3)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾;(4)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾。46.如權利要求45所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。47.如權利要求46所述的方法,其中,降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾選自編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。48.如權利要求47所述的方法,其中,降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾為編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman的內源性基因完全缺失,即被刪除。49.如權利要求17所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。50.如權利要求49所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。51.如權利要求50所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶的內源性基因完全缺失,即被刪除。52.如權利要求45所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。53.如權利要求52所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。54.如權利要求53所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶的內源性基因完全缺失,即被刪除。55.如權利要求45所述的方法,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。56.如權利要求55所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。57.如權利要求56所述的方法,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag的內源性基因完全缺失,即被刪除。58.如權利要求1-57中任一項所述的方法,其中,重組核酸分子被裝入質粒中或重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。59.如權利要求58所述的方法,其中,所述重組核酸分子的表達是可誘導的。60.如權利要求59所述的方法,其中,所述重組核酸分子的表達可由乳糖誘導。61.如權利要求1所述的方法,其中,所述培養步驟A)在20℃-45℃進行。62.如權利要求61所述的方法,其中,所述培養步驟A)在33℃-37℃進行。63.如權利要求1所述的方法,其中,所述培養步驟A)在pH4.5-pH8.5進行。64.如權利要求63所述的方法,其中,所述培養步驟A)在pH6.7-pH7.2進行。65.如權利要求1所述的方法,其中,所述培養步驟A)采用補料發酵法。66.如權利要求65所述的方法,其中,補糖液包含葡萄糖和核糖,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為10%-85%,核糖濃度以重量/體積百分比計為0.5%-15%。67.如權利要求66所述的方法,其中,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為55%-75%,核糖濃度以重量/體積百分比計為5%-7%。68.如權利要求65所述的方法,其中,補糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸鹽,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為10%-85%,葡萄糖酸鹽濃度以重量/體積百分比計為0.5%-15%。69.如權利要求68所述的方法,其中,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為55%-75%,葡萄糖酸鹽濃度以重量/體積百分比計為2%-3%。70.如權利要求69所述的方法,其中,葡萄糖酸鹽為葡萄糖酸鈉。71.如權利要求65所述的方法,其中,補糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸鹽,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為10%-85%,核糖濃度以重量/體積百分比計為0.5%-15%,葡萄糖酸鹽濃度以重量/體積百分比計為0.5%-15%。72.如權利要求71所述的方法,其中,葡萄糖濃度以重量/體積百分比計為55%-75%,核糖濃度以重量/體積百分比計為5%-7%,葡萄糖酸鹽濃度以重量/體積百分比計為2%-3%。73.如權利要求72所述的方法,其中,葡萄糖酸鹽為葡萄糖酸鈉。74.如權利要求1所述的方法,其中,所述收集步驟B)包括(a)從去除微生物的發酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖;和/或(b)從去除微生物的發酵液中結晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。75.如權利要求74所述的方法,其中,所述收集步驟B)進一步包括將發酵液脫色的步驟。76.如權利要求75所述的方法,其中,所述脫色步驟在對發酵液進行沉淀或結晶之前、在對發酵液進行一次或多次沉淀或結晶重溶解之后進行。77.如權利要求75所述的方法,其中,所述脫色步驟包括活性炭處理和/或色譜脫色。78.如權利要求1所述的方法,其中,進一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脫乙酰化得到D-氨基葡萄糖鹽。79.如權利要求78所述的方法,其中,所述鹽選自鹽酸鹽、硫酸鹽、鈉鹽、磷酸鹽和硫酸氫鹽。80.如權利要求78所述的方法,其中,所述步驟C)在酸性和加熱條件下進行或在酶催化下進行。81.如權利要求80所述的方法,其中,在30%-37%鹽酸溶液中、60℃-90℃下脫乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖鹽酸鹽。82.如權利要求80所述的方法,其中,在UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脫乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖,并進一步成鹽。83.一種微生物,該微生物用包含編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列的重組核酸分子轉化,編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列含有增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的酶活性的遺傳修飾,所述遺傳修飾為在對應于氨基酸序列SEQ ID NO:17的第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被組氨酸取代。84.如權利要求83所述的微生物,其中,編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸序列為SEQ ID NO:26。85.如權利要求83所述的微生物,其中,重組核酸分子中編碼N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的基因拷貝數增加。86.如權利要求83所述的微生物,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。87.如權利要求86所述的微生物,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。88.如權利要求83所述的微生物,其中,所述微生物進一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種:(1)包含至少一種能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾,并同時包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾;(2)包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾,并同時包含至少一種能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾;(3)包含至少一種能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾。89.如權利要求88所述的微生物,其中,提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性增加;和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶被過量表達。90.如權利要求89所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。91.如權利要求89所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的核酸序列的重組核酸分子轉化。92.如權利要求91所述的微生物,其中,編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的核酸序列含有至少一種增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性的遺傳修飾。93.如權利要求92所述的微生物,其中,重組核酸分子中編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因拷貝數增加。94.如權利要求92所述的微生物,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。95.如權利要求94所述的微生物,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。96.如權利要求89所述的微生物,其中,微生物包括至少一種對編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。97.如權利要求96所述的微生物,其中,編碼D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。98.如權利要求97所述的微生物,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。99.如權利要求88所述的微生物,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低;和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表達減少。100.如權利要求99所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。101.如權利要求100所述的微生物,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。102.如權利要求101所述的微生物,其中,降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的內源性天然啟動子完全缺失,即被刪除。103.如權利要求88所述的微生物,其中,提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加;和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被過量表達。104.如權利要求103所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。105.如權利要求103所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重組核酸分子轉化。106.如權利要求105所述的微生物,其中,編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一種增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遺傳修飾。107.如權利要求106所述的微生物,其中,重組核酸分子中編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷貝數增加。108.如權利要求106所述的微生物,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。109.如權利要求108所述的微生物,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。110.如權利要求103所述的微生物,其中,微生物包括至少一種對編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。111.如權利要求110所述的微生物,其中,編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。112.如權利要求111所述的微生物,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。113.如權利要求88所述的微生物,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的酶活性降低;和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的表達減少。114.如權利要求113所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。115.如權利要求114所述的微生物,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。116.如權利要求115所述的微生物,其中,降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶基因的內源性天然啟動子完全缺失,即被刪除。117.如權利要求88所述的微生物,其中,提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾選自a)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的酶活性增加;和/或b)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶被過量表達。118.如權利要求117所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。119.如權利要求117所述的微生物,其中,微生物用包含編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列的重組核酸分子轉化,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列含有增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的酶活性的遺傳修飾,所述遺傳修飾為在對應于氨基酸序列SEQ ID NO:43的第34位半胱氨酸被絲氨酸取代、第145位組氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位纈氨酸被甘氨酸取代。120.如權利要求119所述的微生物,其中,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的核酸序列為SEQ ID NO:49。121.如權利要求119所述的微生物,其中,重組核酸分子中編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因拷貝數增加。122.如權利要求119所述的微生物,其中,重組核酸分子中包含內源性天然啟動子或具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子。123.如權利要求122所述的微生物,其中,具有比內源性天然啟動子更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。124.如權利要求117所述的微生物,其中,微生物包括至少一種對編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因的內源性天然啟動子的遺傳修飾。125.如權利要求124所述的微生物,其中,編碼UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-異構酶的基因的內源性天然啟動子被具有更高表達水平的啟動子替換。126.如權利要求125所述的微生物,其中,具有更高表達水平的啟動子選自HCE啟動子、gap啟動子、trc啟動子、T7啟動子。127.如權利要求83-126任一項所述的微生物,其中,所述微生物進一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種:(1)包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾;(2)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾;(3)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾;(4)包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾。128.如權利要求127所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。129.如權利要求128所述的微生物,其中,降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾選自編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。130.如權利要求129所述的微生物,其中,降低微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman作用的遺傳修飾為編碼微生物中甘露糖轉運蛋白EIIM,P/IIIman的內源性基因完全缺失,即被刪除。131.如權利要求127所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。132.如權利要求131所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。133.如權利要求132所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰神經氨酸裂解酶的內源性基因完全缺失,即被刪除。134.如權利要求127所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。135.如權利要求134所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。136.如權利要求135所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶的內源性基因完全缺失,即被刪除。137.如權利要求127所述的微生物,其中,微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉化。138.如權利要求137所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾選自編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag的內源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活,和/或編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag基因的內源性天然啟動子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。139.如權利要求138所述的微生物,其中,降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag作用的遺傳修飾為編碼微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特異酶IINag的內源性基因完全缺失,即被刪除。140.如權利要求83-139中任一項所述的微生物,其中,重組核酸分子被裝入質粒中或重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。141.如權利要求140所述的微生物,其中,所述重組核酸分子的表達是可誘導的。142.如權利要求141所述的微生物,其中,所述重組核酸分子的表達可由乳糖誘導。143.如權利要求1-57中任一項所述的方法,其中,所述微生物為細菌或真菌。144.如權利要求143所述的方法,其中,細菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的屬的細菌。145.如權利要求144所述的方法,其中,細菌選自大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)的種的細菌。146.如權利要求145所述的方法,其中,細菌為大腸桿菌。147.如權利要求146所述的方法,其中,大腸桿菌選自K-12、B和W菌株。148.如權利要求143所述的方法,其中,所述真菌為酵母,所述酵母選自糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluveromyces)和紅法夫屬(Phaffia)的酵母。149.如權利要求148所述的方法,其中,酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大畢赤酵母(Pichia canadensis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)或紅法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。150.如權利要求143所述的方法,其中,真菌選自曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉屬(Rhizopus)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、脈孢霉屬(Neurospora)或木霉屬(Trichoderma)的屬的真菌。151.如權利要求150所述的方法,其中,真菌選自黑曲霉(Aspergillus niger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、藍色犁頭霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopusoryzae)、勞肯諾溫斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)、間型脈孢霉(Neurosporaintermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。152.如權利要求83-139中任一項所述的微生物,其中,所述微生物為細菌或真菌。153.如權利要求152所述的微生物,其中,細菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的屬的細菌。154.如權利要求153所述的微生物,其中,細菌選自大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)的種的細菌。155.如權利要求154所述的微生物,其中,細菌為大腸桿菌。156.如權利要求155所述的微生物,其中,大腸桿菌選自K-12、B和W菌株。157.如權利要求152所述的微生物,其中,所述真菌為酵母,所述酵母選自糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluveromyces)和紅法夫屬(Phaffia)的酵母。158.如權利要求157所述的微生物,其中,酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大畢赤酵母(Pichia canadensis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)或紅法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。159.如權利要求152所述的微生物,其中,真菌選自曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉屬(Rhizopus)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、脈孢霉屬(Neurospora)或木霉屬(Trichoderma)的屬的真菌。160.如權利要求159所述的微生物,其中,真菌選自黑曲霉(Aspergillus niger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、藍色犁頭霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopusoryzae)、勞肯諾溫斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)、間型脈孢霉(Neurosporaintermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。161.一種具有更高酶活性的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶,所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。162.一種編碼如權利要求161所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸異構酶的核酸分子,所述核酸分子具有SEQ ID NO:26所示的核酸序列。163.一種包含如權利要求162所述核酸分子的載體。164.一種包含如權利要求163所述載體的微生物。165.一種基因組中包含如權利要求162所述核酸分子的微生物。
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