本發(fā)明屬于寄生蟲(chóng)分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種土壤中弓形蟲(chóng)的分子檢測(cè)方法，尤其涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)土壤環(huán)境中弓形蟲(chóng)卵囊的方法。本發(fā)明的特征是，通過(guò)設(shè)計(jì)一套弓形蟲(chóng)的特異性引物，提取被檢土壤樣品中總DNA，LAMP擴(kuò)增，采用顯色方法或瓊脂糖凝膠電泳方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析，判定所述樣品中弓形蟲(chóng)是否為陽(yáng)性或陰性。本發(fā)明的另一特點(diǎn)是在所述的LAMP反應(yīng)體系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，從而降低了土壤環(huán)境中PCR抑制因子對(duì)LAMP反應(yīng)的干擾，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率。本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地將被檢土壤樣品中的弓形蟲(chóng)檢測(cè)出來(lái)，同時(shí)適用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)以及環(huán)境中弓形蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)。

1.一種土壤中弓形蟲(chóng)的分子檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)設(shè)計(jì)弓形蟲(chóng)特異引物對(duì)，提取被檢土壤樣品總
DNA，采用環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析以判定待測(cè)土壤樣品中所述弓形蟲(chóng)是否為陽(yáng)性或陰性，
其步驟如下：
(1)根據(jù)報(bào)道的登錄號(hào)為EU572718的弓形蟲(chóng)MIC3基因序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)，所述的引物對(duì)的核苷酸序
列如下所示：
外引物對(duì)F3：5’-TAGATGTATTGATGACGCCTCG-3’；
外引物對(duì)B3：5’-TATTCATTTTTTCACTCAAGCTCC-3’；
內(nèi)引物對(duì)BIP：5’-AATTCGGCATCAGCGCGTCCCCCGATTCTCCTTTCCCAT-3’；
內(nèi)引物對(duì)FIP：5’-GACTTCGACTCCTTCCACACACGGAGAATGCTACACCTGCGAGT-3’；
促環(huán)形成引物對(duì)LF：5’-CTCCGCCTTGAAGTCACTC-3’；
促環(huán)形成引物對(duì)BF：5’-GATCTGCTTCCGCAACCTCC-3’；
(2)待檢土壤樣品的處理：將同一地點(diǎn)不同位置所采的土壤混合并自然晾干，過(guò)20目分析篩，去除土壤
中的石頭及雜草；
(3)待檢土壤樣品中DNA的提取：
1)將處理過(guò)的0.5g的土壤與0.5g的直徑為0.5mm的玻璃珠混合加入pH為8.0的2mL裂解緩沖液渦旋
3min直至土壤樣品被打散，在70℃下水浴1h；
2)將步驟1)的土壤樣品在5000r/min下離心10min，保留上清備用；
3)將步驟2)的沉淀用DNA提取液洗一次，于12000r/min下離心10min，幷將得到的沉淀溶于1.5mL
的DNA提取液中，得到混合物；
4)將步驟3)的混合物分別置于-20℃及65℃下水浴，循環(huán)3次，于12000r/min下離心10min后取清
并與步驟2)的上清合并；
5)用體積比為25∶24∶1的等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液抽提2次，取水相加等體積的異丙醇沉
淀；
6)將步驟5)的樣品在12000r/min下離心10min，用100μL滅菌水溶解沉淀；
7)用DNA純化柱純化DNA樣品；
(4)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增：
1)建立環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：2.5μL?10×BstDNA聚合酶緩沖液，7.0mmol/L?MgCl₂，1.0ng/
μL牛血清白蛋白，1mol/L甜菜堿，1.4mmol/L脫氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6
μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物L(fēng)F和引物L(fēng)B，8U的BstDNA聚合酶，2μL?DNA
模板，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至25μL，其中陽(yáng)性對(duì)照為土壤中提取的弓形蟲(chóng)DNA，陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水；
2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min后加入8U的BstDNA聚合酶至上述除酶以外的反應(yīng)體系中，
再將其放置于63.5℃反應(yīng)50min，然后80℃作用5min后終止反應(yīng)；
3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析：采用顯色反應(yīng)或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，所述的顯色反應(yīng)的步驟
為：加入1-2μL的熒光顯色劑1000×SYBR?Green?I至25μL的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的最終產(chǎn)物，在自
然光下用肉眼觀(guān)察結(jié)果，若擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色則為弓形蟲(chóng)陽(yáng)性，若擴(kuò)增產(chǎn)物為棕色則為弓形蟲(chóng)陰
性；
所述的瓊脂糖凝膠電泳步驟為：取25μL的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的最終反應(yīng)產(chǎn)物10μL，加入至含有
0.5μg/mL溴化乙錠染料的2％的瓊脂糖凝膠中，于100V電壓下電泳30min，在凝膠成相系統(tǒng)上成
像觀(guān)察結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物為由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜為弓形蟲(chóng)陽(yáng)性；
其中
步驟(3)的1)中的裂解緩沖液的組分及配比為：pH為8.0的50mmol/L?Tris，20mmol/L的EDTA，
100mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸鈉，補(bǔ)足雙蒸水至1L；
步驟(3)的3)中DNA提取液的組分及配比為：pH為8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的
EDTA，100mmol/L的NaCl，補(bǔ)足雙蒸水至1L。