1.一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株，其特征在于：根據(jù)蝦白斑綜合征病毒W(wǎng)SSV
囊膜蛋白vp28基因設(shè)計特異性引物序列：
上游引物p1：5’
TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC3’，
下游引物p2：5’
GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG3’，以病毒核酸為模板
擴(kuò)增WSSV囊膜蛋白vp28基因片段并將其插入到真核表達(dá)載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)
化至鹽藻細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)基因藻株；所述的真核表達(dá)載體為能夠轉(zhuǎn)化至鹽藻細(xì)胞中的載體
PBI-，并在鹽藻細(xì)胞中得以表達(dá)；
制備方法如下：
WSSV囊膜蛋白基因的制備步驟如下：
1）WSSV的基因組的制備：取WSSV感染病蝦組織，采用30-65%蔗糖濃度，進(jìn)行常
規(guī)低溫梯度離心法提純WSSV，提純后進(jìn)行電鏡觀察鑒定病毒純度和完整性，取純化病毒
加入TE緩沖液，用蛋白酶K在65℃消化10min后，再加入1/10體積NaAc，用等體積酚
和氯仿分別抽提一次后，用冷無水乙醇沉淀，然后加入TE溶解，即得到純凈的WSSV的
DNA；
2）WSSV囊膜基因vp28基因的擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的vp28的序列設(shè)計引
物，其中vp28的上游引物p1：5’
TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC3’，下游引
物p2：5’
GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG3’，上下游引物分別引入XbaⅠ和
BamHⅠ，下劃線所指，以上述提取的WSSV的DNA為模板PCR擴(kuò)增vp28，PCR的擴(kuò)
增體系及反應(yīng)條件如下：
![]()
PCR反應(yīng)程序：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃10min，
經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到WSSV囊膜蛋白vp28基因片段；
pBI-vp28真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程如下：
將酶切鑒定和測序鑒定均正確的vp28基因進(jìn)行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，然后采用膠
回收方法純化基因片段，將真核載體PBI-221進(jìn)行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，同樣進(jìn)行膠
回收，收集酶切好的載體片段，將切好的基因片段和載體片段按照下列體系建立連接反應(yīng)，
連接體系于16℃水浴放置過夜，次日將該體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑起陽性菌落后進(jìn)行
質(zhì)粒的提取，采用XbaⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，連接體系如下：
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pBI-vp28重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽藻中的方法如下：
采用電擊法將重組質(zhì)粒pUΩ-vp28轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞，具體操作步驟為：收集對數(shù)生長期
的鹽藻細(xì)胞，計數(shù)，用2×HEPES電擊液調(diào)整細(xì)胞濃度，取400μl2×HEPES懸浮的細(xì)胞，
加入重組質(zhì)粒，混勻后加入到0.2cm電擊杯內(nèi)，于冰浴中靜置10min后進(jìn)行電擊，電擊參
數(shù)為：電阻400Ω，電壓1.5kV進(jìn)行電擊；電擊完畢后置于冰浴中靜置5min，然后棄去電
擊液，用PKS培養(yǎng)基懸浮后暗培養(yǎng)12h，然后正常光照培養(yǎng)40h，光:暗比為14:10，采用
固體選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，直至可見單藻落的出現(xiàn)，同時，設(shè)置陰性對照組，該組的
實驗操作過程相同，惟一不同之處即不加入重組質(zhì)粒；
表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)化鹽藻株的篩選和鑒定方法如下：
取生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)基因鹽藻細(xì)胞，離心5min沉淀鹽藻體，然后采用常規(guī)基因組提
取法提取鹽藻基因組DNA，以鹽藻基因組DNA作為模板，進(jìn)行目的基因vp28的PCR擴(kuò)
增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用Trizol試劑提取法提取鹽藻的
總RNA，采用RT-PCR的方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，以查明目的基因在轉(zhuǎn)錄水平是否表達(dá)，
選取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化株，連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月以上，獲得表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化株，同
時，進(jìn)行Western?blot分析，對目的蛋白的表達(dá)量和活性進(jìn)行分析鑒定。
2.一種如權(quán)利要求1所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株的制備方法，其特征在于：
所述的制備方法如下：
WSSV囊膜蛋白基因的制備步驟如下：
1）WSSV的基因組的制備：取WSSV感染病蝦組織，采用30-65%蔗糖濃度，進(jìn)行常
規(guī)低溫梯度離心法提純WSSV，提純后進(jìn)行電鏡觀察鑒定病毒純度和完整性，取純化病毒
加入TE緩沖液，用蛋白酶K在65℃消化10min后，再加入1/10體積NaAc，用等體積酚
和氯仿分別抽提一次后，用冷無水乙醇沉淀，然后加入TE溶解，即得到純凈的WSSV的
DNA；
2）WSSV囊膜基因vp28基因的擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的vp28的序列設(shè)計引
物，其中vp28的上游引物p1：5’
TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC3’，下游引
物p2：5’
GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG3’，上下游引物分別引入XbaⅠ和
BamHⅠ，下劃線所指，以上述提取的WSSV的DNA為模板PCR擴(kuò)增vp28，PCR的擴(kuò)
增體系及反應(yīng)條件如下：
![]()
PCR反應(yīng)程序：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃10min，
經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到WSSV囊膜蛋白vp28基因片段；
pBI-vp28真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程如下：
將酶切鑒定和測序鑒定均正確的vp28基因進(jìn)行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，然后采用膠
回收方法純化基因片段，將真核載體PBI-221進(jìn)行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，同樣進(jìn)行膠
回收，收集酶切好的載體片段，將切好的基因片段和載體片段按照下列體系建立連接反應(yīng)，
連接體系于16℃水浴放置過夜，次日將該體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑起陽性菌落后進(jìn)行
質(zhì)粒的提取，采用XbaⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，連接體系如下：
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pBI-vp28重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽藻中的方法如下：
采用電擊法將重組質(zhì)粒pUΩ-vp28轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞，具體操作步驟為：收集對數(shù)生長期
的鹽藻細(xì)胞，計數(shù)，用2×HEPES電擊液調(diào)整細(xì)胞濃度，取400μl2×HEPES懸浮的細(xì)胞，
加入重組質(zhì)粒，混勻后加入到0.2cm電擊杯內(nèi)，于冰浴中靜置10min后進(jìn)行電擊，電擊參
數(shù)為：電阻400Ω，電壓1.5kV進(jìn)行電擊；電擊完畢后置于冰浴中靜置5min，然后棄去電
擊液，用PKS培養(yǎng)基懸浮后暗培養(yǎng)12h，然后正常光照培養(yǎng)40h，光:暗比為14:10，采用
固體選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，直至可見單藻落的出現(xiàn)，同時，設(shè)有陰性對照組，該組的
實驗操作過程相同，惟一不同之處即不加入重組質(zhì)粒；
表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)化鹽藻株的篩選和鑒定方法如下：
取生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)基因鹽藻細(xì)胞，離心5min沉淀鹽藻體，然后采用常規(guī)基因組提
取法提取鹽藻基因組DNA，以鹽藻基因組DNA作為模板，進(jìn)行目的基因vp28的PCR擴(kuò)
增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用Trizol試劑提取法提取鹽藻的
總RNA，采用RT-PCR的方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，以查明目的基因在轉(zhuǎn)錄水平是否表達(dá)，
選取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化株，連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月以上，獲得表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化株，同
時，進(jìn)行Western?blot分析，對目的蛋白的表達(dá)量和活性進(jìn)行分析鑒定。
3.一種如權(quán)利要求1所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株在制備預(yù)防或治療白斑
綜合征病毒藥物中的應(yīng)用。
4.一種如權(quán)利要求1所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株在制備甲殼類動物養(yǎng)殖
飼料及飼料添加劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的甲殼類動物包括蝦、螃蟹、蝲
蛄。
