本發(fā)明公開一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因檢測用引物組、快速診斷試劑盒和檢測方法。本發(fā)明的試劑盒由前述引物組、Bst DNA聚合酶、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、顯色液和陽性對照液組成，該試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性。本發(fā)明的快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低，而且鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，更加明顯可靠。

1.一種通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測Roundup?Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS
基因的引物組，其特征在于該引物組由外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和
內(nèi)引物BIP組成，其中：
外引物F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；
外引物B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；
內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；
內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；
或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示；
外引物B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6所示；
內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示；
內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：8所示。
2.一種通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測Roundup?Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基
因的快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒由權(quán)利要求1所述引物組、Bst?DNA
聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對照液組成，以上六種液體分別置于
容器中，其中，所述反應(yīng)液的配方為：每1L反應(yīng)液中含有1.6～2mmol?dNTP、
20～25mmol?Tris-HCl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～
10mmol硫酸鎂、1～1.25ml?TritonX-100、0.8～1mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各
1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；所述陽性對照為EPSPS基因DNA片
段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速診斷試劑盒，其特征在于所述的顯色液為
SYBR?Green?I或EvaGreen。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速診斷試劑盒，其特征在于所述每1L反應(yīng)液中
含有2mmol?dNTP、25mmol?Tris-HCl、12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、
10mmol硫酸鎂、1.25ml?TritonX-100、1mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol
和外引物F3/B3各0.25mol。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟
油。
6.一種利用權(quán)利要求2所述快速診斷試劑盒檢測Roundup?Ready轉(zhuǎn)基因大
豆EPSPS基因的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：
(1)待測樣品DNA的制備；
(2)在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38～40體積％，Bst?DNA聚合酶0.9～1.8體
積％，穩(wěn)定液52～54.5體積％，樣品模板DNA?4.5～9體積％，恒溫反應(yīng)；
(3)在上述反應(yīng)管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色
與對照組相同則為陽性，否則為陰性；
其中，步驟(2)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63～65℃，反應(yīng)時(shí)間45～
90min。