本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以3’-核苷酸酶為標(biāo)簽的重組蛋白表達純化系統(tǒng)及方法和應(yīng)用。一種以3’-核苷酸酶為標(biāo)簽的重組蛋白表達純化系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)包括：1）3’-核苷酸酶核苷酸序列和蛋白超表達載體；2）加入蛋白酶識別位點的3’-核苷酸酶核苷酸序列；3）與所述的蛋白酶識別位點相匹配的蛋白酶核苷酸序列；4）含有Li和Ca至少一種離子的裂解液；5）含有Li和Ca至少一種離子的螯合劑的洗脫液；6）PAP瓊脂糖凝膠。本發(fā)明是一種簡便、高效、經(jīng)濟的純化所需目標(biāo)重組蛋白的體系。

1.一種以3’-核苷酸酶為標(biāo)簽的重組蛋白表達純化方法，該方法包括以下的步驟：
1)利用PCR方法克隆3’-核苷酸酶核苷酸序列，并通過PCR引物設(shè)計加入人鼻病毒3C蛋
白酶識別位點，所述的3’-核苷酸酶核苷酸序列合成的正向引物為
GGAATTCCATATGCACCACCACCACCACCACGCATTGGAAAGAGAATTATTGG；反向引
物：AAGCTTCAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGGGCGTTTCTTGACTGAATGAC，
其中下劃線編碼人鼻病毒3C蛋白酶識別序列；
2)3’-核苷酸酶核苷酸序列和蛋白超表達載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，將3’-核苷酸酶核苷
酸序列連接入蛋白超表達載體，構(gòu)建表達載體I；所述的蛋白超表達載體采用pET24a，所述
的3’-核苷酸酶核苷酸序列和pET24a分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde?I/Hind?III雙酶切后，利用T4
連接酶連接構(gòu)建表達載體I，后續(xù)的多克隆位點用于插入目標(biāo)蛋白基因序列；
3)獲取目標(biāo)蛋白的核苷酸序列，目標(biāo)蛋白的核苷酸序列和表達載體I經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，
目標(biāo)蛋白的核苷酸序列連接入表達載體I構(gòu)建目標(biāo)蛋白的表達載體II；
4)獲取與所述的蛋白酶識別位點相匹配的蛋白酶核苷酸序列，蛋白酶核苷酸序列和蛋白超表
達載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，蛋白酶核苷酸序列連接入蛋白超表達載體構(gòu)建蛋白酶表達載
體III；PCR法克隆的人鼻病毒3C蛋白酶核苷酸序列的正向引物為
CCCAAGCTTGGACCAAACACAGAATTTGC；反向引物為
CCGCTCGAGTTATTGTTTCTCTACAAAAT；人鼻病毒3C蛋白酶核苷酸序列和pET24a蛋白
超表達載體，分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind?III/Xho?I雙酶切后，利用T4連接酶連接構(gòu)建表達載
體III；
5)獲取3’-核苷酸酶核苷酸序列，3’-核苷酸酶核苷酸序列和蛋白酶表達載體III經(jīng)酶切后，
3’-核苷酸酶核苷酸序列連接入蛋白酶表達載體III，構(gòu)建表達載體IV；PCR法克隆的3’-核
苷酸酶核苷酸序列的正向引物為
GGAATTCCATATGCACCACCACCACCACCACGCATTGGAAAGAGAATTATTGG；反向引物
為AAGCTTGGCGTTTCTTGACTGAATGAC；3’-核苷酸酶核苷酸序列和表達載體III分別經(jīng)
限制性內(nèi)切酶Nde?I/Hind?III雙酶切后，利用T4連接酶連接構(gòu)建表達載體IV；
6)表達載體II、表達載體IV利用表達菌株高效表達融合蛋白II和融合蛋白IV；
7)將含融合蛋白細胞分別加入含有Li⁺和Ca²⁺至少一種離子的裂解液，上分別樣至PAP瓊脂
糖凝膠柱，經(jīng)過緩沖液洗滌后，利用含有螯合劑的洗脫液將融合蛋白洗脫下來，分別獲得融
合蛋白II和融合蛋白IV；
8)在酶切體系中酶切過夜，融合蛋白IV可酶切融合蛋白II，形成游離的3’-核苷酸酶和目標(biāo)
蛋白；
9)過夜酶切后，融合蛋白IV、3’-核苷酸酶和目標(biāo)蛋白的混合物上樣至PAP瓊脂糖凝膠，融
合蛋白IV和3’-核苷酸酶被結(jié)合，目標(biāo)蛋白不結(jié)合凝膠柱而流出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以3’-核苷酸酶為標(biāo)簽的重組蛋白表達純化方法，其特征在于：
步驟7)中所述的裂解液包括50mM?KCl、10mM?CaCl₂、1mM?DTT、290μM?PMSF、1.5μ
M?PepstatinA、0.1mg/mL溶菌酶、50mM?Hepes緩沖液，pH?8.0；所述的緩沖液包括高鹽緩
沖液和低鹽緩沖液，高鹽緩沖液包括4M?NaCl、10mM?CaCl₂、50mM?Hepes緩沖液，pH?8.0，
低鹽緩沖液包括50mM?NaCl、10mM?CaCl₂、50mM?Hepes緩沖液，pH?8.0；所述的洗脫液
包括50mM?KCl、5mM?EGTA、50mM?Hepes緩沖液，pH?8.0；所述的步驟8)中酶切體系
包括50mM?KCl、5mM?DTT、50mM?Hepes緩沖液，pH?8.0。
3.權(quán)利要求1所述的一種以3’-核苷酸酶為標(biāo)簽的重組蛋白表達純化方法用于純化分離大腸
桿菌蛋白APSK、鯽魚瘦素蛋白或琯溪蜜柚ζ-胡蘿卜素脫飽和酶。