本發明公開了牛HIF?1A基因轉錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，并提供了具體檢測方法，試劑盒包括有以下試劑：2×SYBR GREEN MIX、標準HIF?1A基因模板、超純水和由引物一和引物二組成引物對，引物一如序列表中序列1所示，引物二如序列表中序列2所示。本發明的有益效果為：本發明提供的試劑盒，可以有效檢測不同牛種、不同組織、不同時期的HIF?1A基因的mRNA表達狀態和表達量，同時可以鑒定該基因與動物低氧適應能力的相關性，以滿足生命科學、動物醫學和動物科學研究者的檢測需要。與現有技術相比，本發明的優點在于：1、本發明實現了方便快捷的檢測HIF?1A基因轉錄水平的目的；2、本發明在檢測基因轉錄水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優勢。

1.用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的引物對，其特征在于，是由引物一和引物二組成
的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。
2.用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，包括有以下試劑：2×SYBR
GREEN MIX、標準HIF-1A基因模板、權利要求1所述的引物對和超純水。
3.根據權利要求2所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，所述
試劑盒中，2×SYBR GREEN MIX、標準HIF-1A基因模板、權利要求1所述的引物對和超純水的
配比為5mL：500μL：500μL：5mL。
4.根據權利要求3所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，所述
2×SYBR GREEN MIX由以下試劑組成：Taq DNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4 mmol/L、Mg²⁺
5.0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、Tris.HCl 20 mmol/L、明膠0.02%、SYBR Green染料。
5.根據權利要求4所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，所述
標準HIF-1A基因模板如序列表中序列3所示，標準HIF-1A基因模板的濃度為0.8μmol/L。
6.根據權利要求5所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，權利
要求1所述的引物對組成的引物混合液中，引物一的濃度為8μmol/L，引物二的濃度為8μ
mol/L。
7.根據權利要求6所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，所述
超純水的純度大于18.25 MΩ.cm。
8.用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步
驟：
1）配制熒光定量PCR反應預混液：取2×SYBR GREEN MIX 1000μL、權利要求1-7任一所
述的引物對組成的引物混合液100μL、超純水800μL充分混勻，配制得到1900μL的熒光定量
PCR反應預混液；
2）將步驟1）得到的熒光定量PCR反應預混液按19μL/管分裝成100小管，加至熒光定量
專用PCR反應管或反應板中；
3）配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀釋度的標準HIF-1A基因模板，以及未
稀釋的標準HIF-1A基因模板，共6種，每種10μL，用于檢測基因的擴增效率；
4）熒光定量PCR反應擴增：每個裝有19μL 熒光定量PCR反應預混液的反應管或反應板
中分別加入1μL待測cDNA、作為陰性對照的超純水或作為陽性對照和計算擴增效率標準的
HIF-1A基因模板，震蕩混勻，瞬時離心后上機到熒光定量PCR儀中，95 ℃下變性30秒，然后
按95 ℃ 5秒，55.2 ℃ 20 秒熱循環40次，并在55.2 ℃時檢測記錄熒光信號；
5）PCR反應結束后，讀取各個反應的Ct值用以定量分析；同時于3%瓊脂糖凝膠進行PCR
產物電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應的結果。
9.根據權利要求8所述的用于檢測牛HIF-1A基因轉錄水平的熒光定量PCR檢測方法，其
特征在于，所述步驟4）中，裝有19μL 熒光定量PCR反應預混液的100個小管中，其中1管加入
作為陰性對照的超純水、6管加入作為陽性對照和計算擴增效率標準的HIF-1A基因模板，其
余小管加入待測cDNA。