本發明公開了一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。包括：捕獲探針、VC檢測引物T7引物和nT7引物、VC檢測探針、M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶等試劑。本發明試劑盒能夠檢測食品中的VC RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100 CFU/ml)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)及快速檢測(常規50分鐘完成檢測)的特點，將在霍亂弧菌快速檢測中發揮重要作用，應用前景廣闊。

1.一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條序列表
中序列1所示的霍亂弧菌VC的靶標核酸即VC?RNA的捕獲探針，一對用于在M-MLV反
轉錄酶作用下產生VC靶標核酸VC?RNA的DNA拷貝的VC檢測引物T7和nT7，一條用
于與在T7RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸VC?RNA的DNA拷貝產生的RNA拷貝
特異結合的VC檢測探針，一條用于與VC核苷酸序列互為競爭、與捕獲探針特異性結
合并使用同一對引物即T7和nT7的VC內標核苷酸即VC?IC?RNA，和一條與VC內標核
苷酸的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異性結合的VC內標檢測探針；
所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC檢測引物由T7引物
和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列
4所示；所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光
基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；所述VC內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序
列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包含有M-MLV反轉
錄酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，
所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物、VC檢測探針和VC內
標檢測探針存在于一VC檢測液中。
3.根據權利要求1至2任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含裂解液、
核酸提取液、洗滌液、VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照
和VC內標，其中：
裂解液：含硫酸銨((NH₄)₂SO₄)和HEPES；
核酸提取液：含捕獲探針和磁珠；
洗滌液：含NaCl和SDS；
VC反應液：含dNTP和NTP；
VC檢測液：含T7引物、nT7引物、VC檢測探針和內標檢測探針；
SAT酶液：含M-MLV反轉錄酶、T7RNA聚合酶；
VC陽性對照；含霍亂弧菌toxR的體外轉錄RNA稀釋物；
VC陰性對照：不含有霍亂弧菌靶標核酸序列或不含有霍亂弧菌的溶液；
VC內標：VC?IC?RNA，序列如序列表中序列7所示。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述VC陰性對照為生理鹽水。
5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中一個反應單位中各
種試劑組成如下：
(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；
(2)核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕獲探
針1-50μM，磁珠50-500mg/L；
(3)洗滌液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，1％SDS，EDTA1-10mM；
(4)VC反應液：Tris10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，
PVP401-10％，KCl5-40mM；
(5)VC檢測液：將VC檢測引物和VC檢測探針溶解在TE溶液，10mM?Tris和1mM
EDTA的混合液中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應。
(6)SAT酶液：M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應、T7RNA聚合酶200-2000U/反
應、2-10mM?HEPES?pH7.5、10-100mM?N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM?zinc?acetate、
10-100mM?trehalose、40-200mM?Tris-HCl?pH8.0、40-200mM?KCl、0.01-0.5mM?EDTA、
體積百分比0.1-1％Triton?X-100和體積百分濃度20-50％glycerol；
(7)VC陽性對照；含10⁵-10⁸拷貝/mL霍亂弧菌(VC)toxR的體外轉錄RNA稀釋
物；
(8)VC陰性對照：不含有霍亂弧菌靶標核酸序列或不含有霍亂弧菌的溶液；
(9)VC內標：含10⁵-10⁸拷貝/mL?VC?IC?RNA體外轉錄RNA稀釋物。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：試劑(2)核酸提取液中，捕獲
探針5-25μM，磁珠50-250mg/L；試劑(4)VC反應液中，dNTP濃度為0.5-5mM，
NTP濃度為1-10mM；試劑(5)VC檢測液中，T7引物濃度為12.5pmol/反應，nT7引物
濃度為12.5pmol/反應，VC檢測探針濃度為5pmol/反應，內標檢測探針濃度為5pmol/
反應；試劑(6)SAT酶液中，M-MLV反轉錄酶為500-1500U/反應，T7RNA聚合酶為
500-1000U/反應。
7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于：由A盒即標本處理單元和B
盒即核酸擴增檢測單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌
液，B盒包裝所述VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照及VC
內標。
8.根據權利要求5至7中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述VC陽性對照中
的體外轉錄的VC?RNA以下述方法制備：
(1)用化學合成法合成VC?toxR中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區
域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；
(2)將片段克隆到載體中，構建VC陽性對照質粒；
(3)VC陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5α中，命名為菌株，貯存于
-70℃；
(4)純化去除DNA，并定量、鑒定RNA；
存在VC內標時，體外轉錄的VC?IC?RNA以下述方法制備：
(1)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VC靶標
序列區域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；
(2)將片段克隆到載體中，構建VC內標質粒；
(3)VC內標質粒轉化到大腸桿菌DH5α中，命名為IC菌株，貯存于
-70℃；
(4)純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。