本發明的目的在于提供一種滿足我國動物防疫需求、敏感、特異、能夠準確診斷布魯氏菌病的新一代布魯氏菌病抗體競爭酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒。它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖作抗原包被酶標板，用滅活菌液免疫健康牛或人工感染健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，用新型單克隆抗體作競爭抗體，抗Fc受體的蛋白質AG酶標物作為二抗，配制血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、HO、終止液，組裝組成。本發明是一種敏感、特異、能夠準確診斷布魯氏菌病的競爭ELISA試劑盒，本發明滿足我國動物防疫的需求，借助實驗室診斷技術對布魯氏菌病進行最后確診。

1.一種布魯氏菌病抗體競爭酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒，其特
征在于：它是利用平滑型布魯氏菌的脂多糖作抗原包被酶標板，用滅
活菌液免疫健康牛或人工感染健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性
血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，用單克隆抗體作競爭抗
體，抗Fc受體的蛋白質AG酶標記物為二抗，配制血清稀釋液、洗滌
液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、終止液，組裝組成；所述的抗原
包被酶標板是這樣制備的：
(1)包被：無菌條件下，將凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的
體積，用0.05M?pH9.6的碳酸緩沖液按1∶1000稀釋，以100μl/孔，
包被聚苯乙烯96孔板，加蓋于4℃過夜；
(2)洗滌：以0.01mol/L，pH值為7.2的PBST作洗滌液，加
入足量，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復3次，或用洗板機重復洗
3次，拍干至無水印為止；
(3)封閉：用含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH值為6.3的
PBST按100ul/孔，加入至酶標板中，37℃作用1小時，甩去，加入
足量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復3次，或用洗板機重
復洗3次，拍干至無水印為止，自然干燥；
(4)包裝：將封閉好的酶標板放于鋁箔袋中，加入1g包裝的干
燥劑，用真空包裝機將酶標板包裝好，貼上標簽；
所述的陽性對照血清的制備方法如下：
(1)制造用動物：制備陽性血清的牛需要經過實驗室檢測，必須
是18月齡性成熟、健康牛，無小腸結腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、
大腸桿菌0：157感染，以及無繁殖系統感染等抗體陰性的健康牛；觀
察一周；
(2)免疫原制備：將布氏桿菌S1119.3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，
置37℃培養48小時，待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，
用含0.5％苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中，加甲醛
溶液至終濃度為0.2％，置37℃振蕩滅活48小時，經無菌檢驗合格，于4
℃以20000轉/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做10倍稀釋，
用作免疫原，于2℃～8℃冰箱保存備用；
(3)免疫程序：用免疫原按5ml/點分4點肌肉注射，免疫動物，
14日后，同法免疫一次，再14日后采血，分離血清，用ELISA檢測；
血清OD_450nm和陰性血清OD_450nm的比值(P/N)＞1方可大量采血；如檢
驗不合格，應再加強免疫一次；
(4)血清制造：以常規方法采血，分離其血清，將其作為待檢
血清，用血清稀釋液作1∶2，1∶4...…1∶128稀釋，用質控強陽性
血清作參照進行ELISA試驗，取待檢血清OD_650nm/質控強陽性血清
OD_650nm值＝1時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數，用血清稀釋液
對血清進行稀釋；
(5)分裝：將血清用0.45μm的濾器進行抽濾除菌，無菌條件
下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為0.02％以防腐，然后無菌條
件下定量分裝、凍干，貼上標簽；
(6)標準弱陽性血清制造：將強陽性血清用血清稀釋液作1∶1.5
稀釋；
所述的陰性對照血清的制備方法如下：
(1)制造用動物??同陽性對照血清的制造用動物；
(2)血清制造??以常規方法采血，分離其血清；
(3)血清處理與分裝??將血清用0.45μm的濾器進行抽濾除菌，
無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為0.02％以防腐，然
后無菌條件下定量分裝，貼上標簽；
所述的新型動物布魯氏菌病單克隆抗體制備方法如下：
(1)雜交瘤細胞株的培養：將雜交瘤細胞株從液氮中取出，置
于37℃水浴中迅速融化，1000轉/分鐘離心沉淀細胞，去掉凍存液，
加入10mlMEM培養基，分成兩個培養瓶于37℃二氧化碳培養箱中培養，
2-3天細胞長滿培養瓶底后，進行細胞計數；
(2)腹水新型單克隆抗體的制備：按0.5ml/只腹腔注射小鼠降
植烷，三天后，再按5X10^5-6/只的細胞濃度腹腔注射雜交瘤細胞，約
十天后產生腹水，每天采一次，連續采2-3次，腹水取出后，3000
轉/min離心10min，收集上清并混合，于56℃水浴處理10分鐘，-80
℃凍存為半成品；
(3)中間品檢驗：無菌檢驗??按“獸藥典”進行，應無菌生
長；
(4)效價測定：取出質檢過的動物布魯氏菌病抗原包被酶標板，
每孔加入動物布魯氏菌病抗體競爭ELISA診斷試劑盒的樣品稀釋液
45ul，動物布魯氏菌病標準陰性血清5ul，加2排孔，標準陽性血清5ul，
加2排孔，動物布魯氏菌病單克隆抗體以1∶10倍比稀釋，每個稀釋度
加2列，26℃孵育30分鐘.單克隆抗體效價為OD₄₅₀為0.60至1.80時的
單抗稀釋倍數；
(5)成品制備：按效價檢測結果將單抗稀釋，分裝成0.2ml/
瓶，密封瓶口，貼好標簽，注明批次；
所述的血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、終止
液是這樣配制的：
(1)10倍洗液PBST的配制：
氯化鈉，8克；磷酸二氫鉀，0.2克；磷酸氫二鈉12H₂O，6.29克；
加蒸餾水至100毫升，加0.5毫升吐溫20；調pH值7.2，10磅高壓15
分鐘；
(2)10倍樣品稀釋液的配制：
氯化鈉，8.5克；磷酸二氫鉀，0.2克；磷酸氫二鈉12H₂O，6.29
克；0.5毫升吐溫20，EDTA，5.7克，加蒸餾水至100毫升，pH6.3，
10磅高壓15分鐘；
(3)10倍底物A溶液的配制：
取檸檬酸4.2g，醋酸鈉13.5g，過氧化脲0.5g，加去離子水100ml，
調pH值4.0，過濾除菌；分裝：1.2ml/瓶分裝，密封瓶口，粘貼
標簽；
(4)底物B溶液的配制：
取TMB?0.2192g，二甲基亞砜20ml，室溫下溶解；分裝：0.2ml/
瓶分裝于黑瓶，密封瓶口，粘貼標簽；
(5)H₂O₂液的配制：
分裝：由美國VWR公司生產，0.2ml/瓶分裝于黑瓶，密封瓶口，
粘貼標簽；
(6)10倍終止液的配制：
取55.6毫升98％的濃硫酸加入80毫升水中，調至總體積100毫升；
分裝：1.2毫升/瓶分裝于小瓶，密封瓶口，粘貼標簽、批次。