一種基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物檢測試劑盒及方法。該試劑盒包括8種試劑：裂解液、PCR反應液、dNTP混合物、Taq酶液、2×SYBR？Premix？Ex？Taq反應預混液、引物對、陽性對照及陰性對照等。本發明提供了沙門氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲、折光馬爾太蟲和急性病毒性壞死病毒(AVNV)等5種病原生物的特異引物。本發明充分利用了熒光定量PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，反應結束便可根據擴增曲線即時判定待檢測組織樣本中是否含有上述該五種病原中的一種或幾種及其含量，由于提供了退火溫度相近的特異引物，因此能夠同時對上述5種病原生物進行檢測。本發明能夠快速、特異的完成檢測，方法簡便，具有很高的推廣價值。<!-- 2 -->

1.一種基于PCR的貝類多種病原生物檢測試劑盒，包括：
(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，其濃度分別為1-10mg/mL，10-50mmol/L
和1-10mmol/L，pH為7.5-8.5；
(2)PCR反應液：含濃度為2.5mmol/L的dATP,dTTP,dCTP和dGTP的四種dNTP混
合液及濃度為20-30mmol/L的MgCl₂；
(3)Taq酶液：5U/μL；
(4)2×SYBRPremixExTaq反應預混液；
(5)引物對：
沙門氏菌：
普通PCR引物—上游引物：5’-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3’
下游引物：5’-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3’
熒光定量PCR引物—上游引物：5’-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3’
下游引物：5’-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3’
派琴蟲：
普通PCR引物—上游引物：5’-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3’
下游引物：5’-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3’
熒光定量PCR引物—上游引物：5’-GCTCTTCTTCCCGATACAAACA-3’
下游引物：5’-TAATACGCCTGCCTTCACAAG-3’
AVNV：
普通PCR引物—上游引物：5’-TCTTTACCATGAAGATACCCACC-3’
下游引物：5’-GTGCACGGCTTACCATTTTT-3’
熒光定量PCR引物—上游引物：5’-AGCCTTTTACAGAATTTTGCACCTT-3’
下游引物：5’-TGTCGCATGTTAACCTCGTCTG-3’
副溶血弧菌：
普通PCR引物—上游引物：5’-CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3’
下游引物：5’-TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3’
(6)滅菌去離子水；
(7)陽性對照：含有沙門氏菌、副溶血弧菌、AVNV、派琴蟲和折光馬爾太蟲5種
病原DNA模板的混合液；
(8)陰性對照：ddH₂O；
其特征在于所述的(5)引物對還包括以下引物：
副溶血弧菌：
熒光定量PCR引物—上游引物：5’-CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3’
下游引物：5’-TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3’
折光馬爾太蟲：
普通PCR引物—上游引物：5’-CCGCACACGTTCTTCACTCC-3’
下游引物：5’-CTCGCGAGTTTCGACAGACG-3’
熒光定量PCR引物—上游引物：5’-TACCTAGCGGGTTTTGCTACTC-3’
下游引物：5’-GTCTACGACGACACGATAATGC-3’。