本發明提供了用于熔解曲線分析的核酸探針特別是自淬滅探針，利用所述核酸探針進行熔解曲線分析來檢測核酸序列變異的方法，以及包含所述核酸探針的試劑盒。

1.用于檢測核酸是否存在變異或變異類型的方法，所述方法不用
于疾病診斷，并且包括：
(1)針對需要檢測核酸序列變異的核酸制備探針，其中所述探針
是自淬滅探針，其標記了熒光基團和淬滅基團，使得與不存在靶核酸
序列的情況相比，該探針和靶核酸序列雜交時熒光或熒光強度增加，
并且，所述探針不包含能夠抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修飾；
(2)通過不對稱PCR擴增含有待檢測核酸的片段，其中，在所述
不對稱PCR中，反應混合物中一種PCR擴增引物相對過量，它所延伸
而產生的鏈與探針雜交，并且在擴增前在擴增反應中加入所述探針，
并且，所述不對稱PCR所使用的聚合酶具有外切酶活性；
(3)擴增結束后對步驟(2)所獲得的含有所述探針的擴增產物
進行熔解曲線分析，根據自淬滅探針所對應的熔點或者所述探針和待
檢測核酸序列之間雜交體的熔點或者該熔點的差異來判斷待檢測核酸
是否具有變異以及任選地判斷可能的變異類型。
2.用于檢測核酸是否存在變異或變異類型的方法，所述方法不用
于疾病診斷，并且包括：
(1)針對基因組中一個或多個待檢是否各包含一種或多種具有靶
序列變異的待檢等位核酸序列的核酸區段，制備能夠覆蓋所述待檢核
酸區段的數量的探針，并于PCR反應開始前將所述探針加入下述(2)
的反應體系中，其中所述探針是自淬滅探針，其標記了熒光基團和淬
滅基團，使得與不存在靶核酸序列的情況相比，該探針和靶核酸序列
雜交時熒光或熒光強度增加，并且，所述探針不包含能夠抵抗DNA聚
合酶的核酸外切酶活性的修飾；
(2)通過不對稱PCR在PCR反應體系中擴增基因組中所述一個或
多個待檢是否各包含一種或多種具有所述靶序列變異的所述待檢等位
核酸序列的核酸區段，在所述不對稱PCR中，反應混合物中一種PCR
擴增引物相對過量，且它所延伸而產生的鏈與探針雜交，并且，所述
不對稱PCR所使用的聚合酶具有外切酶活性；
(3)仍于所述反應體系中，在逐步升溫下監控步驟(1)中制備
的各探針與步驟(2)中擴增的各待檢等位核酸序列的相互作用所致的
熒光變化，從而同時得到所述各探針所對應的熔解曲線；
(4)對通過步驟(3)得到的熔解曲線求導，并取其負導數-dF/dT，
從而得到所述各探針所對應的熔點；及
(5)通過比較步驟(4)得到的對應于各待檢等位核酸序列和各
探針之間的熔解溫度來分析各待檢等位核酸序列間是否存在靶序列變
異。
3.權利要求1或2的方法，其中，所述變異是單核苷酸變異。
4.權利要求1或2的方法，其中，所述擴增反應中包含參照核酸
或者野生型核酸。
5.權利要求1或2的方法，其中，在所述探針的5'末端標記熒
光基團而在3'末端標記淬滅基團，或在所述探針的3'末端標記熒光基
團而在5'末端標記淬滅基團。
6.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的序列包含或者是野
生型或變異靶核酸序列的完全互補序列。
7.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的序列與野生型或變
異靶核酸序列的完全互補序列相比具有一個或多個錯配。
8.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1-10個錯配。
9.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1-5個錯配。
10.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1-4個錯配。
11.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1-3個錯配。
12.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1-2個錯配。
13.權利要求7的方法，其中，所述探針具有1個或2個錯配。
14.權利要求7的方法，其中，所述錯配是單堿基的轉換、顛換、
插入或缺失。
15.權利要求1或2的方法，其中，所述熒光基團包括或者選自
下列標記物：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE,
HEX,CAL?Orange560、TAMRA、CAL?Red590、ROX、
CAL?Red610、TEXAS?RED、CALRed635、Quasar670、
CY3、CY5、CY5.5和/或Quasar705。
16.權利要求1或2的方法，其中，所述淬滅基團包括或者選自
下列淬滅劑：DABCYL、BHQ類淬滅劑、ECLIPSE和/或TAMRA。
17.權利要求16的方法，其中，所述BHQ類淬滅劑選自BHQ-1
和BHQ-2。
18.權利要求1或2的方法，其中，所述探針由未經修飾的堿基
組成。
19.權利要求1或2的方法，其中，所述探針包含能增強或減弱
探針結合能力的堿基。
20.權利要求19的方法，其中，所述能增強探針結合能力的堿基
包括鎖定核酸堿基。
21.權利要求19的方法，其中，所述能減弱探針結合能力的堿基
包括通用結合堿基I。
22.權利要求1或2的方法，其中，所述探針是線性探針，其長
度為5-100個堿基。
23.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為10-100
個堿基。
24.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為10-50個
堿基。
25.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為15-50個
堿基。
26.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為20-50個
堿基。
27.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為10-40個
堿基。
28.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為10-20個
堿基。
29.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為20-30個
堿基。
30.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為30-40個
堿基。
31.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為15-30個
堿基。
32.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為20-40個
堿基。
33.權利要求1或2的方法，其中，所述探針的長度為15-25個
堿基。
34.權利要求3的方法，其中，所述單核苷酸變異是同一物種的
不同個體間的同一基因座位上的核酸序列中的一個或多個相同或不同
位置的單堿基的轉換、顛換、插入或缺失，且所述基因組的一個或多
個核酸區段相同或不同。