本發(fā)明提供了人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存、分化技術(shù)。特色步驟包括：1、用含DMEM/DF12等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配制嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基；2、鼻粘膜的獲取；3、雙酶組合消化。4、原代培養(yǎng)：加入嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基制成的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，在CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)；5、傳代培養(yǎng)：收集過(guò)濾培養(yǎng)基上清液，配制傳代培養(yǎng)基；6、超低溫凍存：收集過(guò)濾培養(yǎng)基上清液，配制專(zhuān)用凍存液；7、應(yīng)用前分化培養(yǎng)。本專(zhuān)利選取人上鼻甲嗅區(qū)粘膜進(jìn)行培養(yǎng)增殖、傳代、凍存、分化，能獲得高純度嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞，該細(xì)胞具有綜合神經(jīng)修復(fù)作用，臨床治療研究顯示，這種細(xì)胞能有效修復(fù)神經(jīng)疾病和損害喪失的神經(jīng)功能并改善患者的生存質(zhì)量。

1.一種人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括以下步驟：
(1)配制人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基：A：用DMEM/F12、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF、l％N2、
2％B27、T3神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子按比例配制獲得人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基；B：層流細(xì)胞培養(yǎng)室過(guò)
濾除菌，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br/>(2)將獲自人嗅粘膜組織的人嗅鞘細(xì)胞單細(xì)胞置于離心管中與所述人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞
培養(yǎng)基充分混合種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使之貼壁生
長(zhǎng)；
(3)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并過(guò)濾，獲得過(guò)濾后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
(4)常規(guī)收集培養(yǎng)的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞，獲得人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞；
(5)配置人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基：將步驟(3)獲得的過(guò)濾后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液
與所述人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基以1:3的比例進(jìn)行混合，制成傳代培養(yǎng)基；
(6)將步驟(4)獲得的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞添加到步驟(5)制備的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞的傳
代培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種到培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移至37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培
養(yǎng)，獲得人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，步驟(2)所述人嗅鞘細(xì)胞單細(xì)胞的制備方法
包括以下步驟：用2倍體積的膠原酶Ⅰ和組織分散酶Ⅱ?qū)⑷诵嵴衬そM織在37℃水浴中震蕩消
化得到單細(xì)胞。
3.一種人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括以下步驟：
(1)配制人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基：A：用DMEM/F12、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF、l％N2、
2％B27、T3神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子按比例配制獲得人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)基；B：層流細(xì)胞培養(yǎng)室過(guò)
濾除菌，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br/>(2)將獲自人嗅粘膜組織的人嗅鞘細(xì)胞單細(xì)胞置于離心管中與所述人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞
培養(yǎng)基充分混合種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使之貼壁生
長(zhǎng)；
(3)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并過(guò)濾，獲得過(guò)濾后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
(4)常規(guī)收集培養(yǎng)的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞；
(5)配置人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞專(zhuān)用凍存液：將自體血清、步驟(3)獲得的過(guò)濾后的細(xì)胞培
養(yǎng)上清液、DMEM/F12與DMSO以5:2:2:1的比例進(jìn)行混合，制成人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞專(zhuān)用凍存
液；
(6)將步驟(4)獲得的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)添加到步驟(5)制備的人嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞專(zhuān)用凍
存液，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，常規(guī)程序降溫超低溫凍存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中，步驟(2)所述人嗅鞘細(xì)胞單細(xì)胞的制備方法
包括以下步驟：用2倍體積的膠原酶Ⅰ和組織分散酶Ⅱ?qū)⑷诵嵴衬そM織在37℃水浴中震蕩消
化得到單細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述制備方法還包括：(7)所述嗅鞘
細(xì)胞的分化培養(yǎng)，用配制的膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)液培養(yǎng)，制備高純度嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞。