本發(fā)明涉及一種循環(huán)利用重組大腸桿菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟：采用產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌先有氧培養(yǎng)菌體后厭氧產(chǎn)酸的兩階段發(fā)酵模式生產(chǎn)丁二酸；在兩階段發(fā)酵結(jié)束時(shí)，利用兩階段發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(丁二酸，乙酸，丙酮酸等)有氧誘導(dǎo)細(xì)胞；無(wú)菌收集菌體細(xì)胞，在新鮮培養(yǎng)基中厭氧生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸；厭氧生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后再次有氧誘導(dǎo)，并回收細(xì)胞在新鮮的培養(yǎng)基下繼續(xù)生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸的目的。本發(fā)明技術(shù)方案解決了因有氧菌體培養(yǎng)過(guò)程消耗大量碳源及時(shí)間導(dǎo)致兩階段發(fā)酵整個(gè)過(guò)程丁二酸收率及生產(chǎn)強(qiáng)度偏低的問(wèn)題。

1.?一種循環(huán)利用重組大腸桿菌AFP111細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）利用重組大腸桿菌采用兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸：先有氧培養(yǎng)快速提高菌體密度，繼而轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸；具體地：首先用LB培養(yǎng)基活化菌體，按體積比1%接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12?h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25?g·L^-1，有氧培養(yǎng)至細(xì)胞干重在10～12?g·L^-1，培養(yǎng)過(guò)程溶氧維持在40%以上；改通CO₂氣體，進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補(bǔ)加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過(guò)50?g·L^-1，同時(shí)添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時(shí)調(diào)控pH值6.4～6.8；其中，所述的JSM發(fā)酵培養(yǎng)基是：葡萄糖40?g·L^-1；檸檬酸3?g·L^-1；Na₂HPO₄·7H₂O?3?g·L^-1；KH₂PO_4?8?g·L^-1；(NH₄)₂HPO_4?8?g·L^-1；NH₄Cl?0.2?g·L^-1；(NH₄)₂SO₄?0.75?g·L^-1；MgSO₄·7H₂O?1.00?g·L^-1；CaCl₂·2H₂O?10.0?mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O?0.5?mg·L^-1；CuCl₂·2H₂O?0.25?mg·L^-1；MnSO₄·H₂O?2.5?mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O?1.75?mg·L^-1；H₃BO_3?0.12?mg；Al₂(SO₄)₃·xH₂O?1.77?mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O?0.5?mg·L^-1；檸檬酸鐵?16.1?mg·L^-1；VB₁?20·mg?L^-1；生物素?2?mg·L^-1；（2）利用兩階段發(fā)酵產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物有氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵酶活：兩階段發(fā)酵結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基中無(wú)殘?zhí)?，碳源僅剩中間代謝產(chǎn)物，此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基改通空氣或者氧氣，并維持>40%的溶氧，以中間代謝產(chǎn)物為碳源，培養(yǎng)>2?h，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)丁二酸過(guò)程中的關(guān)鍵酶酶活；（3）無(wú)菌收集菌體細(xì)胞，在新鮮培養(yǎng)基中厭氧生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸；（4）在步驟（3）結(jié)束時(shí)繼續(xù)有氧誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，達(dá)到細(xì)胞重復(fù)循環(huán)利用的目的：待步驟（3）中細(xì)胞葡萄糖的消耗速率下降至0.1?g·L^-1·h^-1，終止厭氧發(fā)酵并轉(zhuǎn)有氧誘導(dǎo)細(xì)胞，繼而實(shí)施步驟（3）。2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（2）中的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵酶活的酶是磷酸烯醇式丙酮酸激酶、異檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸酶、富馬酸酶、富馬酸還原酶、丙酮酸脫氫酶中的一種或者多種。3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（3）的具體方法為：收集已有氧誘導(dǎo)的細(xì)胞菌液，離心或者膜過(guò)濾獲得細(xì)胞，并在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵。