1.一種納米磁粒復合系統(tǒng)的制備方法,包括下述步驟:(1)質粒pHRE-Egr-1-EGFP的制備:將Egr1啟動子置于pIRES載體上,其前有一CMV增強子片段,用以增強Egr1啟動子表達效率,以CMVE-Egr1p序列為模板設計引物,PCR擴增CMVE+Egr1p片段,回收CMVE-Egr1p片段,以MluI+NheI為亞克隆位點,將其亞克隆至pCDNA3.1-EGFP上,構建pCDNA3.1-Egr1-EGFP質粒;轉化后,挑取若干個克隆,提取質粒,進行PCR鑒定;根據PCR電泳結果,選擇正確的pCDNA3.1-Egr1-EGFP進行測序比對;合成5HRE,并在合成5HRE片段時,兩側各加若干個酶切位點,將其插入pUC57載體上,獲得pUC57-5HRE,將合成產物酶切鑒定、基因測序;將pUC57-5HRE和pCDNA3.1-Egr1p-EGFP分別用MluI酶切連接,將連接產物轉化至DH5α中,挑取克隆進行BglII酶切鑒定,選擇正確的克隆進行測序,將測序序列與欲獲得的5HRE序列進行比對;(2)PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米磁粒的制備:按Mn:Zn:Fe的摩爾比為0.5:0.5:2稱取原料MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O,混合后倒入高速研磨杯磨成粉狀,按n(M)∶n(OH–)=1∶2.4,其中M代表所有金屬離子,稱取所需NaOH的量,加適量水溶解,將粉末倒入其中并混勻,不斷攪拌成糊狀,室溫放置12h后,80℃干燥,得到粉末狀前驅體,放入馬弗爐中400℃焙燒1h,?自然冷卻后熱蒸餾水浸洗,過濾,用BaCl2檢測濾液中無白色沉淀后,無水乙醇淋洗一遍,60℃烘干,即得Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米磁粒;稱取一定量的Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米磁粒溶于去離子水中,配制成質量百分比為4%的磁流體,超聲分散后高速離心棄上清;沉淀重懸于PBS緩沖液中,超聲分散后按照PEI與MZF-NPs質量比為1:5的量緩慢加入PEI,充分混勻,恒溫搖床24h使反應充分;用磁分離法將磁性粒子從溶液中分離,經蒸餾水、甲醇反復洗滌,真空干燥后即獲得表面修飾過的Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米磁粒;(3)復合物制備:按PEI-MZF-NPs與pHRE-Egr-1-EGFP質量比為40:1,將質粒pHRE-Egr-1-EGFP和PEI-?MZF-NPs分別用無血清培養(yǎng)基稀釋,室溫放置5分鐘后,將二者混和到一起并混勻,置室溫下孵育30分鐘,即獲得pHRE-Egr-1-EGFP/PEI-?MZF-NPs復合物。
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